【摘要】：目的:胰島細(xì)胞移植技術(shù)通過補(bǔ)充患者的胰島素分泌細(xì)胞,有效地控制血糖代謝,能達(dá)到治愈糖尿病阻止各種并發(fā)癥發(fā)生的目的。但該技術(shù)仍面臨著供體器官稀缺、移植物存活率低等技術(shù)瓶頸。目前我國(guó)供體的唯一來源是公民自愿無償捐獻(xiàn),不少器官缺血時(shí)間長(zhǎng),不可避免的存在缺血損傷。因此,應(yīng)用藥物保存胰島細(xì)胞改善胰島細(xì)胞活率是提高手術(shù)成功率的有效途徑。我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),應(yīng)用代培養(yǎng)技術(shù),建立細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β?lián)p傷模型,探討扶芳藤含藥血清對(duì)細(xì)胞因子損傷大鼠胰島細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)含量及iNOS表達(dá)的影響。方法:提取SD大鼠胰島細(xì)胞,SD大鼠220-250g,予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉開腹后,結(jié)扎胰膽管近肝門端,自大鼠胰膽管十二指腸端注入10ml預(yù)冷的膠原酶V(0.75mg/ml),輕輕拉出腫脹的胰腺,剔除周圍其他組織并獲取胰腺。隨后各組大鼠的胰腺于37℃水浴箱中消化15分鐘并輕輕搖動(dòng)。加入4℃Hank’s液終止消化并用600μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾,收集濾液中的細(xì)胞并在密度梯度分別為1.108、1.096、1.069和1.037的Ficoll中離心,從交界層面收集胰島,并以4℃Hank’s液洗滌。分離后的胰島細(xì)胞按20IEQ/孔的密度重新接種于24孔培養(yǎng)板中。每個(gè)培養(yǎng)孔的總體積為500ul。采用隨機(jī)數(shù)表法將胰島細(xì)胞隨機(jī)分為3組,每組8孔(n=8),分別為空白對(duì)照組:胰島細(xì)胞予含10%新鮮胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);模型對(duì)照組:胰島細(xì)胞予含10%新鮮胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基+細(xì)胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)觀察組:胰島細(xì)胞予含10%扶芳藤含藥血清的RPMI-1640培養(yǎng)基+細(xì)胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培養(yǎng);各組均培養(yǎng)于37℃、含95%空氣和5%CO_2的恒溫培養(yǎng)箱中。丫啶橙(AO)/碘丙啶(PI)染色法雙染細(xì)胞并于不同激發(fā)波長(zhǎng)的熒光下對(duì)體外胰島細(xì)胞進(jìn)行拍照觀察,計(jì)算評(píng)估胰島細(xì)胞活率。ELISA試劑盒進(jìn)行細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)水平測(cè)定。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胰島細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá),Western-blot技術(shù)檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果:培養(yǎng)1d后各組胰島細(xì)胞活性均有所下降,模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞活率明顯下降(P0.05);3d后,各組胰島細(xì)胞活性均明顯下降,與空白對(duì)照組相比模型對(duì)照組細(xì)胞活率大幅下降(P0.05);與模型對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)觀察組細(xì)胞活率明顯提高(P0.05);7d后,各組胰島細(xì)胞活性均大幅下降,與空白對(duì)照組相比模型對(duì)照組細(xì)胞活率大幅下降(P0.05);與實(shí)驗(yàn)觀察組相比模型對(duì)照組細(xì)胞活率明顯下降(P0.05);胰島經(jīng)過24h培養(yǎng)后胰島素釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,空白對(duì)照組的胰島刺激指數(shù)為2.96±0.12;模型對(duì)照組的刺激指數(shù)為2.26±0.14;實(shí)驗(yàn)觀察組的刺激指數(shù)為2.75±0.26。模型對(duì)照組的刺激指數(shù)較空白對(duì)照組明顯降低(P0.05);模型對(duì)照組的刺激指數(shù)較實(shí)驗(yàn)觀察組顯著降低(P0.05).通過對(duì)各組胰島細(xì)胞GSH含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組的GSH含量為4.12±0.28umol/g prot;模型對(duì)照組的GSH含量為2.69±0.32 umol/g prot;實(shí)驗(yàn)觀察組的GSH含量為3.43±0.43 umol/g prot;模型對(duì)照組的GSH含量較空白對(duì)照組明顯降低(P0.05),模型對(duì)照組的GSH含量較實(shí)驗(yàn)觀察組顯著降低(P0.05);比較各組胰島細(xì)胞NO含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組的NO含量為41.59±4.39 umol/L;模型對(duì)照組的NO含量為56.91±10.09 umol/L;實(shí)驗(yàn)觀察組的NO含量為43.65±2.57 umol/L。模型對(duì)照組NO含量較空白對(duì)照組明顯升高(P0.05);模型對(duì)照組的NO含量較實(shí)驗(yàn)觀察組顯著升高(P0.05);利用RT-PCR方法檢測(cè)各組胰島細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示模型對(duì)照組的iNOS mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高,(P0.05);模型對(duì)照組的iNOS mRNA表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)觀察組顯著升高,(P0.05);利用Western-blot檢測(cè)各組胰島細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):模型對(duì)照組的iNOS蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高(P0.05);模型對(duì)照組的iNOS蛋白的表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)觀察組顯著升高(P0.05)。結(jié)論:細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β能誘導(dǎo)胰島細(xì)胞iNOS的過表達(dá),生成大量NO對(duì)胰島細(xì)胞胰島素分泌功能造成損傷,降低細(xì)胞存活率,加重細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,減少胰島細(xì)胞GSH含量。扶芳藤可能通過阻斷細(xì)胞iNOS的過表達(dá),抑制NO大量生成,提高GSH含量,減輕細(xì)胞因子對(duì)胰島的損害。
【圖文】：

在灌及胰為 0腺體灌注前破心胰島的分離0.75mg／體組織呈分心放血處死離的過程。ml)10ml分葉狀，邊死大鼠，，。之后連接逆行注入邊灌注邊10注意勿使接注射器入胰膽管內(nèi)邊將大鼠脾使血液流入將預(yù)冷的內(nèi)。灌注過脾臟提起使入胰腺周圍的 4℃膠原過程可見胰使胰腺灌注圍影響胰腺原酶 V 溶液胰腺逐漸膨注充分，避腺消化液(濃度膨脹，避免胰

胰膽管穿刺遣入灌注釗頭
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2690116