【摘要】：目的:胰島細胞移植技術通過補充患者的胰島素分泌細胞,有效地控制血糖代謝,能達到治愈糖尿病阻止各種并發(fā)癥發(fā)生的目的。但該技術仍面臨著供體器官稀缺、移植物存活率低等技術瓶頸。目前我國供體的唯一來源是公民自愿無償捐獻,不少器官缺血時間長,不可避免的存在缺血損傷。因此,應用藥物保存胰島細胞改善胰島細胞活率是提高手術成功率的有效途徑。我們設計實驗,應用代培養(yǎng)技術,建立細胞因子TNF-α、IL-1β?lián)p傷模型,探討扶芳藤含藥血清對細胞因子損傷大鼠胰島細胞谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)含量及iNOS表達的影響。方法:提取SD大鼠胰島細胞,SD大鼠220-250g,予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉開腹后,結扎胰膽管近肝門端,自大鼠胰膽管十二指腸端注入10ml預冷的膠原酶V(0.75mg/ml),輕輕拉出腫脹的胰腺,剔除周圍其他組織并獲取胰腺。隨后各組大鼠的胰腺于37℃水浴箱中消化15分鐘并輕輕搖動。加入4℃Hank’s液終止消化并用600μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾,收集濾液中的細胞并在密度梯度分別為1.108、1.096、1.069和1.037的Ficoll中離心,從交界層面收集胰島,并以4℃Hank’s液洗滌。分離后的胰島細胞按20IEQ/孔的密度重新接種于24孔培養(yǎng)板中。每個培養(yǎng)孔的總體積為500ul。采用隨機數(shù)表法將胰島細胞隨機分為3組,每組8孔(n=8),分別為空白對照組:胰島細胞予含10%新鮮胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);模型對照組:胰島細胞予含10%新鮮胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基+細胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培養(yǎng);實驗觀察組:胰島細胞予含10%扶芳藤含藥血清的RPMI-1640培養(yǎng)基+細胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培養(yǎng);各組均培養(yǎng)于37℃、含95%空氣和5%CO_2的恒溫培養(yǎng)箱中。丫啶橙(AO)/碘丙啶(PI)染色法雙染細胞并于不同激發(fā)波長的熒光下對體外胰島細胞進行拍照觀察,計算評估胰島細胞活率。ELISA試劑盒進行細胞谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)水平測定。運用RT-PCR技術檢測胰島細胞iNOS mRNA的表達,Western-blot技術檢測iNOS蛋白表達。結果:培養(yǎng)1d后各組胰島細胞活性均有所下降,模型對照組與空白對照組相比細胞活率明顯下降(P0.05);3d后,各組胰島細胞活性均明顯下降,與空白對照組相比模型對照組細胞活率大幅下降(P0.05);與模型對照組相比實驗觀察組細胞活率明顯提高(P0.05);7d后,各組胰島細胞活性均大幅下降,與空白對照組相比模型對照組細胞活率大幅下降(P0.05);與實驗觀察組相比模型對照組細胞活率明顯下降(P0.05);胰島經(jīng)過24h培養(yǎng)后胰島素釋放實驗的結果顯示,空白對照組的胰島刺激指數(shù)為2.96±0.12;模型對照組的刺激指數(shù)為2.26±0.14;實驗觀察組的刺激指數(shù)為2.75±0.26。模型對照組的刺激指數(shù)較空白對照組明顯降低(P0.05);模型對照組的刺激指數(shù)較實驗觀察組顯著降低(P0.05).通過對各組胰島細胞GSH含量的檢測發(fā)現(xiàn),空白對照組的GSH含量為4.12±0.28umol/g prot;模型對照組的GSH含量為2.69±0.32 umol/g prot;實驗觀察組的GSH含量為3.43±0.43 umol/g prot;模型對照組的GSH含量較空白對照組明顯降低(P0.05),模型對照組的GSH含量較實驗觀察組顯著降低(P0.05);比較各組胰島細胞NO含量的檢測發(fā)現(xiàn),空白對照組的NO含量為41.59±4.39 umol/L;模型對照組的NO含量為56.91±10.09 umol/L;實驗觀察組的NO含量為43.65±2.57 umol/L。模型對照組NO含量較空白對照組明顯升高(P0.05);模型對照組的NO含量較實驗觀察組顯著升高(P0.05);利用RT-PCR方法檢測各組胰島細胞iNOS mRNA表達水平,結果顯示模型對照組的iNOS mRNA表達水平較空白對照組明顯升高,(P0.05);模型對照組的iNOS mRNA表達水平較實驗觀察組顯著升高,(P0.05);利用Western-blot檢測各組胰島細胞iNOS蛋白的表達水平,實驗發(fā)現(xiàn):模型對照組的iNOS蛋白的表達水平較空白對照組明顯升高(P0.05);模型對照組的iNOS蛋白的表達水平較實驗觀察組顯著升高(P0.05)。結論:細胞因子TNF-α及IL-1β能誘導胰島細胞iNOS的過表達,生成大量NO對胰島細胞胰島素分泌功能造成損傷,降低細胞存活率,加重細胞的氧化應激損傷,減少胰島細胞GSH含量。扶芳藤可能通過阻斷細胞iNOS的過表達,抑制NO大量生成,提高GSH含量,減輕細胞因子對胰島的損害。
【圖文】：

在灌及胰為 0腺體灌注前破心胰島的分離0.75mg／體組織呈分心放血處死離的過程。ml)10ml分葉狀，邊死大鼠，，。之后連接逆行注入邊灌注邊10注意勿使接注射器入胰膽管內(nèi)邊將大鼠脾使血液流入將預冷的內(nèi)。灌注過脾臟提起使入胰腺周圍的 4℃膠原過程可見胰使胰腺灌注圍影響胰腺原酶 V 溶液胰腺逐漸膨注充分，避腺消化液(濃度膨脹，避免胰

胰膽管穿刺遣入灌注釗頭
【學位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2690116