發(fā)布時間：2020-05-31 16:00

【摘要】：目的:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)惡性程度高,預(yù)后極差。土木香內(nèi)酯(ATL)為半萜內(nèi)酯類的天然植物化合物,體內(nèi)代謝穩(wěn)定,毒副作用少,具有潛在的抗腫瘤活性。第一部分實驗旨在研究ATL對GBM增殖生長的影響,探究可能的分子機制;并驗證ATL能否透過血腦屏障。第二部分研究ATL對GBM遷移侵襲及凋亡情況的影響,探究ATL作用的分子機制及調(diào)控靶點。方法:第一部分實驗中,首先通過MTT法檢測經(jīng)不同濃度ATL處理人神經(jīng)腫瘤細(xì)胞U87、U251、U118、SH-SY5Y及人正常膠質(zhì)細(xì)胞SVG p12后的細(xì)胞活力;經(jīng)ATL處理U87及U251細(xì)胞后,通過細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況,運用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進行檢測,并采用Western Blot方法檢測調(diào)控細(xì)胞周期進程關(guān)鍵蛋白的表達情況。在進一步的分子機制檢測中,我們運用Western Blot、PCR、免疫熒光共聚焦技術(shù),Pulldown以及染色質(zhì)免疫共沉淀等方法,探究經(jīng)ATL處理后,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65/p50的核轉(zhuǎn)位及p300的募集情況,以及它們與COX-2啟動子區(qū)域結(jié)合力的影響。在探尋ATL作用靶點的研究中,本實驗采用體外激酶實驗及分子對接方法,驗證ATL與IKKβ的相互作用。在體內(nèi)實驗研究中,采用異體裸鼠荷瘤實驗,研究ATL在體內(nèi)對腫瘤生長的情況的影響。采用免疫組化檢測ATL對分子機制中關(guān)鍵蛋白表達情況的影響。另外檢測ATL能否透過血腦屏障,我們予大鼠腹腔注ATL后,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測活體腦脊液中ATL的含量。第二部分實驗中,首先采用劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗檢測,經(jīng)不同濃度ATL處理的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株U87、U251細(xì)胞的遷移侵襲能力。在分子機制研究中,運用Western Blot蛋白印跡、激光共聚焦免疫熒光技術(shù),研究基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9的蛋白表達情況,Cofilin蛋白的活化情況,及G-actin與F-actin比例變化情況。另一方面采用流式細(xì)胞儀檢測,經(jīng)不同濃度ATL處理的U87、U251細(xì)胞的中凋亡細(xì)胞數(shù)的變化情況。在分子機制研究中,運用Western Blot蛋白印跡、激光共聚焦免疫熒光技術(shù)及蛋白質(zhì)免疫共沉淀方法,研究Cofilin及Actin向線粒體轉(zhuǎn)位情況,細(xì)胞色素C從線粒體向胞漿的釋放情況,及Caspase級聯(lián)通路中關(guān)鍵蛋白的表達情況。對ATL靶向作用于調(diào)控Cofilin的LIMK酶的研究中,運用預(yù)先加用特異性抑制劑LIMKi的方法,再分別檢測遷移侵襲能力方面及凋亡方面的變化情況。在體內(nèi)實驗研究中,采用Western Blot蛋白印跡及免疫組化實驗檢測ATL對異體裸鼠荷瘤的腫瘤組織中p-cofilin及p-LIMK1/2蛋白表達的影響。結(jié)果:第一部分:ATL能顯著抑制GBM細(xì)胞的增殖生長。其可能分子機制:ATL作用于IKKβ的ATP結(jié)合位點,遏制其磷酸化,從而抑制NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)位,阻礙NF-κB結(jié)合到COX-2的啟動子區(qū)以及p300的募集,下調(diào)COX-2的基因表達,進而抑制GBM的增殖生長;而且ATL能下調(diào)Cyclin D1和CDK4的蛋白表達,阻滯GBM細(xì)胞周期循環(huán)在G0/G1期。在體內(nèi)實驗中也證實了ATL能夠顯著下調(diào)異體荷瘤組織中COX-2及p-p65的蛋白表達水平。另外經(jīng)活體腦脊液檢測發(fā)現(xiàn),ATL能透過血腦屏障。第二部分:一方面ATL能夠顯著抑制GBM細(xì)胞的遷移侵襲能力,其分子機制可能為ATL能激活Cofilin的活性,上調(diào)G-actin與F-actin的比率;另一方面ATL能顯著誘導(dǎo)GBM細(xì)胞的凋亡發(fā)生,其分子機制可能為ATL能激活Cofilin的活性,促使Cofilin與G-actin共轉(zhuǎn)位至線粒體,介導(dǎo)細(xì)胞色素C向胞漿的釋放,啟動Caspase級聯(lián)信號通路誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。在調(diào)控靶點研究中,發(fā)現(xiàn)ATL是通過靶向抑制LIMK酶活性,從而活化Cofilin。在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)ATL能夠顯著下調(diào)異體荷瘤組織中p-cofilin及p-LIMK1/2的蛋白表達水平。結(jié)論:第一部分實驗,發(fā)現(xiàn)ATL通過靶向抑制IKKβ酶活性,干擾NF-κB/COX-2介導(dǎo)的信號通路,以及阻滯細(xì)胞周期循環(huán),從而發(fā)揮抗GBM細(xì)胞增殖生長的作用。另外通過活體實驗證實ATL能透過血腦屏障,為ATL在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病上的應(yīng)用提供了潛在可能。第二部分實驗,發(fā)現(xiàn)ATL能通過干擾LIMK/cofilin信號通路,抑制GBM的遷移侵襲及誘導(dǎo)GBM的凋亡發(fā)生。本部分結(jié)果表明,ATL在抗GBM遷移侵襲及誘導(dǎo)凋亡發(fā)生方面具有潛在的應(yīng)用價值�？傊�,綜合這兩部分的實驗結(jié)果,證實土木香內(nèi)酯存在多途徑、多靶點發(fā)揮抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用,為其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供有力的實驗數(shù)據(jù)。
【圖文】：

圖 2. (A)ATL 分別作用 12h、24h 及 48h 后，MTT 法檢測 ATL 對 U87、U251、U118、SHSY-5Y及 SVG p12 細(xì)胞活力的影響；(B)及作用 48h 后，計算 IC50 值。Figure 2. (A) U87, U251, U118, SH-SY5Y and SVG p12 cells were cultured with the indicatedconcentrations of ATL for the indicated hours; then, MTT assays were performed. (B) At 48 haftertreatment,the IC50 value was calculated. The data are shown as the mean ±SD of three separateexperiments (*P<0.05, **P<0.01, ATL-treated group vs. the DMSO-treated group).

Figure 2. (A) U87, U251, U118, SH-SY5Y and SVG p12 cells were cultured with the indicateconcentrations of ATL for the indicated hours; then, MTT assays were performed. (B) At 48 aftertreatment,the IC50 value was calculated. The data are shown as the mean ±SD of three separaexperiments (*P<0.05, **P<0.01, ATL-treated group vs. the DMSO-treated group).
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張甘露;江皓;;老年膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療進展[J];中華老年病研究電子雜志;2018年01期

2 張文麗;孔凡虹;季楠;李昊文;李奇;何露;康熙雄;王雅杰;;鐵死亡與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)性探討[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2018年02期

3 周良健;張明;劉艷;肖帥;李洪艷;李明;張金嶺;車峰遠(yuǎn);衡雪源;;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤磁共振強化不明顯一例[J];中國腫瘤外科雜志;2018年03期

4 鄒德偉;王俊偉;汪攀;潘金玉;吳南;;幕上膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后頭皮下異位播散轉(zhuǎn)移1例報道[J];重慶醫(yī)學(xué);2018年27期

5 丁德智;侯現(xiàn)增;劉廣存;;復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究進展[J];新醫(yī)學(xué);2016年12期

6 景岳;張文燕;王翠英;趙寶帥;崔靜;;貝伐珠單抗聯(lián)合替莫唑胺同步放療治療新診斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床研究[J];山西醫(yī)藥雜志;2017年11期

7 鄒楊鴻;張翔;嚴(yán)琪;余化霖;;橫紋肌樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤1例報告[J];臨床神經(jīng)病學(xué)雜志;2017年05期

8 張超超;于鳳波;黃海燕;牟青春;;新診斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療進展[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2016年01期

9 張文燕;王翠英;趙寶帥;;聯(lián)用貝伐株單抗和標(biāo)準(zhǔn)療法對新診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進行治療的效果探究[J];當(dāng)代醫(yī)藥論叢;2016年11期

10 劉琦;熊麗;田少斌;陳勁松;;原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后危險因素分析[J];中國臨床神經(jīng)外科雜志;2016年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張勝;鐘百書;錢秉坤;阮凌翔;吳亞萍;張艷艷;熊兵;;快速進展的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的影像表現(xiàn)-附個例報道[A];2015年浙江省醫(yī)學(xué)會放射學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2015年

2 黃丙倉;耿道穎;紀(jì)毅敏;李郁新;朱莉;尹波;鮑奕仿;;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤磁共振成像的一個重要征象——“絲瓜瓤樣壞死征”[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國放射學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2009年

3 秦立森;梁徑山;石瓊;于如同;;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中強化與壞死比例與信號傳導(dǎo)相關(guān)性的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

4 熊劍;章翔;程光;林洪;費舟;;Ardipusilloside Ⅰ誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的研究[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

5 張成龍;李康印;郝曉東;陳虎義;高崎煒;強海霞;;兒童多發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一例[A];2005年全國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)學(xué)術(shù)會議西部論壇論文匯編[C];2005年

6 王勇;陶榮杰;;貝伐單抗一線治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的薈萃分析[A];第八屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第十三屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

7 江濤;陳寶師;袁芳;李桂林;李少武;邱曉光;王忠誠;;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床治療經(jīng)驗[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第二屆全國代表大會論文匯編[C];2007年

8 鄭秀玨;黃欣;李谷;曹飛;龔江標(biāo);;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后同步放化療的臨床分析[A];2009年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

9 路俊鋒;吳勁松;周良輔;;聯(lián)合基因表達譜和拷貝數(shù)變異區(qū)分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與瘤周組織的初步研究[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

10 廖洪飛;雷進;唐軼;吳高峰;龐曉霞;廖述才;張興華;;伽瑪?shù)吨委煻啻螐?fù)發(fā)星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一例報告[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前9條

1 煒聞;Avastin獲準(zhǔn)用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

2 谷文;FDA批準(zhǔn)Avastin 用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[N];中國醫(yī)藥報;2009年

3 匡遠(yuǎn)深;治療首次術(shù)后腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 放化療同步優(yōu)于單純放療[N];中國醫(yī)藥報;2008年

4 吳劍鵬;南方醫(yī)院牽手多家醫(yī)院聯(lián)合開展膠質(zhì)母細(xì)胞瘤研究[N];科技日報;2014年

5 Tracy Staton 編譯 石軍;羅氏公開數(shù)據(jù)證“有效”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2014年

6 鄭敏　講述 本報記者 屠春技 通訊員 陸虹 整理;樓若林：永遠(yuǎn)是庭上最有準(zhǔn)備的那一個[N];檢察日報;2011年

7 洪敏;細(xì)胞凋亡研究引人關(guān)注[N];中國醫(yī)藥報;2008年

8 劉霞;美開發(fā)出專攻致命腦癌的“設(shè)計蛋白”[N];科技日報;2010年

9 李艷;禮來腫瘤新藥獲批歐美孤兒藥資格[N];光明日報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 侯建兵;CSN6在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究[D];西南大學(xué);2018年

2 徐寧波;長鏈非編碼RNA AC003092.1通過miR-195/TFPI2信號通路調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤替莫唑胺耐藥的機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

3 王迅;天然植物化合物土木香內(nèi)酯對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抑制作用的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

4 顧昊;南蛇藤莖提取物通過腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞干預(yù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的機制研究[D];揚州大學(xué);2018年

5 任思陽;miR-19a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達、生物學(xué)功能以及對下游分子影響的機制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

6 于海;XIST、G3BP2和NFAT5調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生的機制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

7 劉群;多發(fā)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的全基因組、表觀基因組分析及分子概況[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

8 賈偉強;Verbascoside治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其分子機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

9 黃夢瑩;MINA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長中的作用及機制研究[D];西南大學(xué);2017年

10 李竹青;復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤再手術(shù)治療的預(yù)后評價[D];中南大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 丁小鵬;雙特異性磷酸酶-2介導(dǎo)姜黃素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

2 李梅;Stupp方案結(jié)合多種藥物在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中干預(yù)效果的系統(tǒng)評價[D];華北理工大學(xué);2018年

3 張磊;成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)治療發(fā)展現(xiàn)狀與進展[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

4 馮俊;南蛇藤提取物對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞凋亡影響的研究[D];揚州大學(xué);2018年

5 馮爽;TRIM22通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖，侵襲和遷移的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

6 劉瑞;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)與腦內(nèi)不同區(qū)域NLGN3水平相關(guān)性的研究[D];武漢大學(xué);2018年

7 孫德超;阿帕替尼單藥治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤療效分析及相關(guān)預(yù)測因子探索性研究[D];鄭州大學(xué);2018年

8 張海鵬;PDGFRα在中國成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達及臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

9 孫磊;基于物理包裹作用制備腫瘤穿透肽修飾PGG-PTX遞藥系統(tǒng)的研究[D];華東師范大學(xué);2017年

10 劉羽;BQ788誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞凋亡及分化提高其放療敏感性的研究[D];華中科技大學(xué);2016年

，

本文編號：2690108