發(fā)布時(shí)間：2020-05-23 20:17

【摘要】：目的通過晝夜不同時(shí)間應(yīng)用青藤堿(sinomenine,SIN)或艾拉莫德(Iguratimod,T-614),分析其對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis,CIA)的治療作用和相關(guān)毒副作用的晝夜差異及其可能機(jī)制,為進(jìn)一步開展時(shí)間治療學(xué)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1青藤堿與艾拉莫德對(duì)CIA大鼠的時(shí)間治療學(xué)及其機(jī)制研究80只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠(體重120±10g),飼養(yǎng)于時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室[明期為08:00~20:00,暗期為20:00~08:00;授時(shí)時(shí)間(Zeitgeber time,ZT),實(shí)驗(yàn)中以ZT0~ZT12為明期],自由攝食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)10天。后將80只大鼠隨機(jī)分成造模組70只,空白組(NG組)10只。造模組大鼠在無菌操作環(huán)境下,分別于0d及14d兩次皮下注射牛Ⅱ型膠原(CⅡ)建立CIA模型。實(shí)驗(yàn)期間(0d-50d)每7天檢測(cè)大鼠右后足容積、體重。于21d將CIA模型成功大鼠,根據(jù)關(guān)節(jié)炎評(píng)分均分至SIN-ZT0、SIN-ZT12、T-614-ZT0、T-614-ZT12組及模型組(M組),每組10只;NG組10只。22d開始進(jìn)行藥物干預(yù),SIN時(shí)間治療組灌胃給予青藤堿(150mg/Kg·d-1,2m L)、T-614時(shí)間治療組灌胃給予艾拉莫德(6mg/Kg·d-1;2m L)、M組及NG組灌胃給予等體積羧甲基纖維素鈉,干預(yù)28天。49d拍攝大鼠足爪X線片,50d于ZT0-ZT3,應(yīng)用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下斷頭處死大鼠,取血,分離血清,低溫保存?zhèn)錂z;取踝關(guān)節(jié),固定,脫鈣,石蠟包埋,石蠟組織切片備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunsorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、褪黑素(Melatonin,MLT)及皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT)含量,蘇木素-伊紅染色法(HE染色法)顯微鏡下觀察足踝滑膜病理改變,免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP技術(shù))檢測(cè)足踝組織TNF-α、IL-1β、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、鐘基因表達(dá)蛋白(CLOCK、BMAL1)表達(dá)情況。2青藤堿與艾拉莫德的時(shí)間毒理學(xué)初步探討60只SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠(體重20±10g),飼養(yǎng)于上述時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性飼養(yǎng)10天,自由攝食飲水。后將小鼠隨機(jī)分至SIN-ZT0、SIN-ZT12、T-614-ZT0、T-614-ZT12、NG組,每組12只。0d~21d進(jìn)行藥物干預(yù),SIN時(shí)間毒理組灌胃給予青藤堿(150mg/Kg·d-1;0.9m L)、T-614時(shí)間毒理組灌胃灌胃給予艾拉莫德(6mg/Kg·d-1;0.9m L)、NG組灌胃給予等體積羧甲基纖維素鈉。22d于ZT0-ZT1斷頭處死小鼠,取血,分離血漿,低溫保存?zhèn)錂z。應(yīng)用微板法檢測(cè)T-614-ZT0、T-614-ZT12、NG組血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Acute suppurative thyroiditis,AST)含量,ELISA法檢測(cè)SIN-ZT0、SIN-ZT12、NG組血漿組胺(Histamine,HIS)含量。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用IBM SPSS21.0軟件處理,計(jì)量資料符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析處理;兩兩比較,方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn);方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。結(jié)果1青藤堿與艾拉莫德對(duì)CIA大鼠的時(shí)間治療學(xué)及其機(jī)制研究1.1一般生長(zhǎng)狀況及體重比較給藥前,關(guān)節(jié)炎大鼠較煩躁,被毛光澤變差、脫毛,精神萎靡,組內(nèi)打斗現(xiàn)象較為頻繁。部分大鼠因足爪腫脹疼痛或關(guān)節(jié)僵直而活動(dòng)受限,因疼痛或者慢性炎癥納食水較少,體型瘦弱。各治療組給藥后,飲食水較給藥前頻繁,脫毛現(xiàn)象減少,光澤度增加。大鼠活動(dòng)量漸增加,組內(nèi)打斗現(xiàn)象減少,關(guān)節(jié)僵直改善。M組大鼠經(jīng)兩次CⅡ免疫后體重增長(zhǎng)出現(xiàn)遲滯現(xiàn)象,藥物干預(yù)后,SIN治療組大鼠體重增長(zhǎng)較NG組緩慢,DAY42、DAY49,SIN治療組大鼠體重高于M組大鼠;其中SIN-ZT0組大鼠體重一直低于SIN-ZT12組,且兩組體重差距逐漸變大。T-614治療組大鼠體重增長(zhǎng)較NG組緩慢,DAY35開始M組大鼠體重始終低于T-614治療組;于DAY42、DAY49,T-614-ZT12組大鼠體重顯著高于M組(P0.05);DAY42,T-614-ZT8組大鼠體重顯著高于M組(P0.05);但T-614-ZT0組大鼠于DAY35開始,體重始終低于T-614-ZT12組。1.2時(shí)間治療組右足容積變化:SIN干預(yù)后,大鼠足爪容積迅速下降,于DAY35、DAY42,SIN-ZT0、SIN-ZT12組大鼠足爪容積顯著低于M組(P0.05);于DAY35、DAY42、DAY49,SIN-ZT12組足爪容積始終低于SINZT0組。T-614干預(yù)后,大鼠足爪容積迅速下降,于DAY28~DAY42,M組足爪容積顯著高于T-614-ZT0、T-614-ZT12組(P0.05);DAY49,M組足爪容積顯著高于T-614-ZT12組(P0.05);且于DAY35~DAY49,T-614-ZT12組足爪容積始終低于T-614-ZT0組。1.3關(guān)節(jié)影像學(xué)變化:給藥4周后,M組可見踝關(guān)節(jié)面模糊,骨缺損明顯,軟組織腫脹較明顯;后足掌指關(guān)節(jié)間隙均勻變窄,骨質(zhì)疏松明顯;大部分大鼠前爪亦出現(xiàn)不同程度關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞,間隙變窄,軟組織腫脹等表現(xiàn)。SIN-ZT0組大鼠踝關(guān)節(jié)破壞及關(guān)節(jié)面模糊程度輕,部分關(guān)節(jié)可見骨缺損,關(guān)節(jié)間隙變窄,骨質(zhì)疏松;SIN-ZT12組大鼠踝關(guān)節(jié)面尚可見,骨破壞程度輕于SIN-ZT0組。T-614-ZT0組大鼠踝關(guān)節(jié)面均可見,可見踝關(guān)節(jié)間隙變窄伴見骨質(zhì)疏松;T-614-ZT12組大鼠踝關(guān)節(jié)面均可見,骨破壞程度較T-614-ZT0組為輕。1.4大鼠血清TNF-α、IL-1β、褪黑素及皮質(zhì)酮含量:4周后,M組大鼠血清細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)、褪黑素含量較NG組顯著升高(P0.01),血清皮質(zhì)酮含量較NG組顯著降低(P0.01);SIN及T-614時(shí)間治療組大鼠血清細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)、褪黑素含量較M組顯著降低(P0.01、P0.05),血清皮質(zhì)酮含量顯著升高(P0.01);SIN及T-614干預(yù)4周后,各自ZT12組血清細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)含量均顯著低于SIN及T-614各自ZT0組(P0.05);SIN及T-614各自ZT12組血清褪黑素含量高于SIN及T-614各自ZT0組(P0.05),而SIN及T-614各自ZT12組與NG組相比無顯著差異(P0.05);SIN及T-614各自ZT12組血清皮質(zhì)酮含量較SIN及T-614各自ZT0組為高(P0.05)。1.5踝關(guān)節(jié)組織病理變化:M組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜HE染色可見4~7層、排列疏松紊亂的滑膜細(xì)胞,部分可見滑膜細(xì)胞乳頭狀增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞聚集現(xiàn)象,嚴(yán)重者可見多核巨噬細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)血管增生,血管翳形成侵蝕骨小梁,軟骨骨破壞。SIN及T-614治療組中,ZT12給藥組滑膜增生均較ZT0給藥組為輕,滑膜細(xì)胞下淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較輕;偶可見滑膜細(xì)胞乳頭狀增生,但仍以ZT0給藥組為重。1.6踝關(guān)節(jié)組織TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL、CLOCK、BMAL1表達(dá):M組大鼠踝關(guān)節(jié)TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL、CLOCK、BMAL1的表達(dá)明顯高于NG組,OPG表達(dá)低于NG組;SIN、T-614治療組與M組比較TNF-α、IL-1β、RANKL、CLOCK、BMAL1的表達(dá)明顯降低,OPG表達(dá)高于M組;SIN及T-614治療組,除OPG外上述指標(biāo)均出現(xiàn)ZT0組較ZT12組表達(dá)高,OPG表達(dá)則出現(xiàn)ZT12組高于ZT0組。2青藤堿與艾拉莫德的時(shí)間毒理學(xué)初步探討2.1小鼠一般生長(zhǎng)狀況及體重變化:NG組小鼠體重在第一周增長(zhǎng)迅速,第二、三周增長(zhǎng)速度逐漸減慢,較活躍。SIN及T-614毒理組小鼠,體重較NG組增長(zhǎng)緩慢,其中ZT12組增長(zhǎng)最慢;干預(yù)后第一、二周活動(dòng)較頻繁,之后活動(dòng)較NG組減少;T-614毒理組偶有組內(nèi)打斗現(xiàn)象及上肢兩側(cè)抓痕導(dǎo)致的脫毛現(xiàn)象。SIN干預(yù)后DAY14、DAY21,SIN-ZT12組體重顯著低于空白組(P0.05);T-614干預(yù)后DAY7、DAY14,T-614-ZT12組體重顯著低于NG組(P0.01);SIN及T-614毒理組,ZT12組體重自干預(yù)后始終低于ZT0組。2.2青藤堿干預(yù)后小鼠血漿組胺含量:SIN干預(yù)3周后,SIN-ZT0、SIN-ZT12組小鼠血漿組胺含量呈現(xiàn)較高水平,均顯著高于NG組(P0.05、P0.01)。其中,SIN-ZT12組顯著高于SIN-ZT0組(P0.05)。2.3艾拉莫德干預(yù)后小鼠血漿AST、ALT含量:T-614干預(yù)3周后,兩組小鼠血漿AST含量較NG組為高,其中T-614-ZT12組顯著高于NG組(P0.05);T-614-ZT12組較T-614-ZT0組稍高。兩組小鼠血漿ALT含量較NG組顯著升高(P0.01);T-614-ZT12組較T-614-ZT0組血漿ALT含量稍高。結(jié)論1青藤堿與艾拉莫德晝夜不同時(shí)間干預(yù)CIA大鼠,治療效果存在晝夜差異,原因與晚8點(diǎn)給予藥物干預(yù)較早8點(diǎn)血清及關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)低表達(dá)及皮質(zhì)酮高表達(dá),滑膜組織OPG高表達(dá)、RANKL低表達(dá)有關(guān)。其機(jī)制可能與褪黑素、鐘基因調(diào)控晝夜皮質(zhì)酮分泌或調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平有關(guān)。2青藤堿與艾拉莫德晝夜不同時(shí)間干預(yù)正常昆明小鼠,出現(xiàn)青藤堿晚8點(diǎn)組血漿組胺表達(dá)高于早8點(diǎn)組;艾拉莫德晚8點(diǎn)組肝功能損傷(AST、ALT)稍高于早8點(diǎn)組,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

骨質(zhì)疏松明顯；M 組大部分大鼠前爪亦出現(xiàn)不同程度關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)間隙均勻變窄，足部軟組織腫脹（圖5B）。不同時(shí)間給藥 4 周后，SIN-ZT0 組大鼠踝關(guān)節(jié)破壞及關(guān)節(jié)面模糊較 M 組不明顯，部分大鼠關(guān)節(jié)面可見骨缺損，關(guān)節(jié)間隙均勻變窄（圖 5C）；SIN-ZT12 組大部分大鼠踝關(guān)節(jié)面尚可見，掌指關(guān)節(jié)面可見骨缺損較少，關(guān)節(jié)間隙輕度均勻變窄（圖5D）。SIN-ZT12 組大鼠骨破壞程度輕于 SIN-ZT0 組。不同時(shí)間給藥 4 周后，T-614-ZT0 組大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面均可見，關(guān)節(jié)間隙輕度變窄（圖 5E）；T-614-ZT12 組大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面均可見，關(guān)節(jié)面較 T-614-ZT0 組多數(shù)清晰，踝關(guān)節(jié)輕度變窄，，軟組織腫脹較 T-614-ZT0 組為輕（圖 5F）。T-614-ZT12 組大鼠骨破壞程度輕于 T-614-ZT0 組。圖 5 各組大鼠足爪 X 線比較（A：正常對(duì)照組；B

圖 6 青藤堿干預(yù)后血清 TNF-α 含量對(duì)比（ x±s）Fig.6 Comparison of serum TNF-α levels after SIN interventionZT0 組比，▲P<0.05；NG 組 vs. M 組，P<0.01；與 M 組比，※P、▲P<0.01；與 NG 組比，。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677896