【摘要】：目的:骨關(guān)節(jié)炎是一種進(jìn)展性的以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯年P(guān)節(jié)疾患,它的預(yù)防,診斷及治療給世界社會經(jīng)濟(jì)醫(yī)療保健帶來重大負(fù)擔(dān)。即使這樣,仍然沒有理想的專門針對骨關(guān)節(jié)炎的治療方法,患者最終只能選擇人工關(guān)節(jié)置換,這種4級骨科大手術(shù)帶來的創(chuàng)傷及并發(fā)癥使一部分高齡患者只能望而卻步。目前的治療藥物僅能暫時緩解膝關(guān)節(jié)疼痛,并不能阻止或減緩骨關(guān)節(jié)的退變。因此目前迫切需要我們更深入的了解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制,找到一種有效的預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。本研究旨在研究(1)異甘草素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中NF-κB通路及降解因子的影響。(2)異甘草素對早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信號通路及TGF-β1的影響。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信號通路探究異甘草素對早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨異常血管形成的影響。方法:(1)異甘草素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中NF-κB通路及降解因子的影響。1.誘導(dǎo)ATDC細(xì)胞系向軟骨細(xì)胞分化:小鼠前軟骨細(xì)胞株,來源于鼠畸胎瘤的ATDC5細(xì)胞系由南京科百生物技術(shù)有限公司提供。分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)第0天,7天,14天,21天進(jìn)行1%阿爾辛藍(lán)染色及通過RT-q PCR測定軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原的表達(dá)量,以確定最佳誘導(dǎo)時間。2.CCK-8及PE-Annexin V/7-ADD雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞分析評估異甘草素對IL-1β干預(yù)后的ATDC軟骨樣細(xì)胞的活性影響:此時分為兩組,一組測定異甘草素單獨(dú)對ATDC軟骨樣細(xì)胞的活性影響,根據(jù)加入異甘草素的濃度分為6組(0μmol/l,2.5μmol/l,5μmol/l,10μmol/l,20μmol/l,40,μmol/l),每組每個點(diǎn)設(shè)定3個復(fù)孔,培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞進(jìn)行CCK-8檢測及雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞分析。另一組測定異甘草素對IL-1β干預(yù)后的ATDC軟骨樣細(xì)胞的活性影響,設(shè)定為空白對照組(無異甘草素及IL-1β),IL-1β干預(yù)組(10ng/ml),及不同濃度的異甘草素治療組(10ng/ml IL-1β+2.5μmol/l異甘草素;10ng/ml IL-1β+5μmol/l異甘草素;10ng/ml IL-1β+10μmol/l異甘草素;10ng/ml IL-1β+20μmol/l異甘草素;10ng/ml IL-1β+40μmol/l異甘草素)。先在軟骨細(xì)胞中加入不同濃度的異甘草素培養(yǎng)1小時后再加入10ng/ml IL-1β,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞進(jìn)行CCK-8檢測及PE-Annexin V/7-ADD雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞分析。3.異甘草素抑制IL-1β干預(yù)ATDC軟骨樣細(xì)胞后的降解反應(yīng):使用TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA用于Real-time PCR分析,測定軟骨細(xì)胞降解標(biāo)記物Ⅱ型膠原(COLⅡ),環(huán)氧合酶-2(COX-2),基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)。4.異甘草素對NF-κB通路的影響:使用蛋白免疫印跡法(Western Blot)測定軟骨細(xì)胞降解過程相關(guān)標(biāo)記物,軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)記物Bcl-2,Bax,caspase-3,cleaved-caspase-3,caspase-9,cleaved-caspase-9,NF-κB通路相關(guān)標(biāo)記物NF-κB-p65,磷酸化的p65(phospho-p65)。(2)異甘草素對骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信號通路及TGF-β1的影響。1.建立C57BL/6J小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型:C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,預(yù)實驗分5個組來選定最佳治療劑量,假手術(shù)組,模型組,腹腔注射異甘草素治療組-低劑量(10mg/kg),異甘草素治療組-中劑量(20mg/kg),異甘草素治療組-高劑量(40mg/kg)。后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選定最佳實驗劑量40mg/kg。采用腹腔注射氯胺酮+安定+阿托品各一支混合稀釋至10ml(0.1ml/10g)麻醉小鼠,麻醉起效后,右膝關(guān)節(jié)部備皮消毒,鋪單,在顯微鏡直視下切斷前交叉韌帶,術(shù)后連續(xù)3天給予皮下注射氨芐青霉素,1次/天。假手術(shù)組只切開關(guān)節(jié)囊,不切斷前叉韌帶,余處理與手術(shù)組相同。2.評估造模后各組間小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的各項指標(biāo):各組小鼠于術(shù)后30天及60天處死,標(biāo)本脫鈣包埋后先用HE染色及番紅-固綠染色,觀察軟骨的退變情況及蛋白聚糖的丟失情況。同時,最后我們用國際骨關(guān)節(jié)炎協(xié)會(Osteoarthritis Research Society International)改良版評分來對關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度給予定量分析。我們采用免疫組織熒光染色及免疫組織化學(xué)染色測定軟骨中的標(biāo)記物lubricin,Ⅹ型膠原(Col X),基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-l3)。3.評估造模后各組間小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的各項指標(biāo),探究異甘草素抑制TRAP+破骨細(xì)胞的機(jī)制:我們將樣本置于三維Micro-CT(Sky Scan1176)掃描,掃描后的數(shù)據(jù)運(yùn)用專用軟件進(jìn)行三維重建及分析(NRecon v1.6,CTAn v1.9和CTVol v2.0),分析各組之間小鼠軟骨下骨骨重建的相關(guān)指標(biāo):包括a.骨體積在同體積中所占有的量(BV/TV);b.骨小梁模式因子(Tb.pf);c.軟骨下骨骨小梁的厚度(SBP Th.)。我們通過免疫組織化學(xué)染色評估了TRAP+的破骨細(xì)胞,Osterix,TGF-β1通路p Smad2/3,通過免疫組織熒光染色測定各組的RANKL,TRAF6,Nestin+的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。此外,通過Elisa試劑盒檢測小鼠體循環(huán)內(nèi)破骨細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信號通路探究異甘草素對軟骨下骨異常血管形成的影響。1.使用三維Micro-CT掃面造影劑灌注后的樣本來分析異甘草素對小鼠軟骨下骨異常血管形成的影響,包括血管的體積及數(shù)量。2.異甘草素對造模后各組間小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨血管形成相關(guān)因子的影響:運(yùn)用免疫熒光染色評估軟骨下骨CD31及Endomucin來確定H型血管(CD31+Endomucin+)的變化。其次檢測了基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)在各組中的變化。結(jié)果:(1)異甘草素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中NF-κB通路及降解因子的影響:1.誘導(dǎo)期第14天,通過1%阿爾新藍(lán)染色可見,ATDC5細(xì)胞系分泌大量的蛋白多聚糖,染色成明顯藍(lán)色,誘導(dǎo)期第21天仍然可以看到明顯的藍(lán)色,但和14天沒有明顯差異。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)14天內(nèi),Ⅱ型膠原的表達(dá)量逐漸上升并在14天達(dá)到峰值,第21天時有明顯下降。同時,Ⅹ型膠原的表達(dá)量逐漸增加,到21天達(dá)到峰值。因此,我們選取誘導(dǎo)14天的ATDC5軟骨樣細(xì)胞作為后續(xù)實驗的樣本。2.異甘草素濃度在10μmol/l以內(nèi)時,對ATDC5軟骨樣細(xì)胞活性未見明顯影響(p0.05),但在20μmol/l及40μmol/l時明顯降低ATDC5軟骨樣細(xì)胞活性,通過流式細(xì)胞分析也同樣可看到,當(dāng)異甘草素濃度升高至20μmol/l時,大量細(xì)胞開始凋亡(p0.05)。10ng/ml IL-1β作用在ATDC5軟骨樣細(xì)胞后細(xì)胞活性明顯降低(p0.05),大量細(xì)胞凋亡,而隨著加入異甘草素的濃度逐漸增多至10μmol/l,細(xì)胞活性逐漸升高,凋亡的細(xì)胞逐漸減少。但異甘草素濃度達(dá)到20μmol/l時,細(xì)胞活性再次明顯降低,大量細(xì)胞凋亡(p0.05)。3.Ⅱ型膠原的表達(dá)量在單純加入10ng/ml IL-1β后有明顯的下降(p0.05),但隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的增加(p0.05)。相反,環(huán)氧合酶2(COX-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達(dá)量在10ng/ml IL-1β刺激后明顯升高(p0.05),但隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的降低(p0.05)。4.在單純加入10ng/ml IL-1β后,Bcl-2表達(dá)明顯降低(p0.05),但隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的增加(p0.05)。與Bcl-2相反,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax基因在加入10ng/ml IL-1β后表達(dá)量明顯升高(p0.05),但隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的降低(p0.05)。Casepase-3及Casepase-9的表達(dá)在各組之間并沒有明顯變化(p0.05),但Cleaved-Casepase-3和Cleaved-Casepase-9作為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的活性成分,在單純加入10ng/ml IL-1β后明顯升高(p0.05),隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的降低。NFκBp65的表達(dá)各組之間并沒有明顯的變化(p0.05),但磷酸化的NFκBp65(p-p65)在單純加入10ng/ml IL-1β后明顯升高(p0.05),隨著加入的異甘草素的濃度逐漸增加,成濃度依賴性的降低(p0.05)。(2)異甘草素對早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信號通路及TGF-β1的影響:1.前交叉韌帶切除術(shù)后30天,60天我們安樂死小鼠,進(jìn)行初期的番紅-固綠染色,發(fā)現(xiàn)模型組在兩個時間點(diǎn)軟骨都有明確的蛋白聚糖的丟失和軟骨面的破壞,而治療組明顯預(yù)防了軟骨內(nèi)蛋白聚糖的丟失和軟骨面的破壞�；诜t-固綠的國際骨關(guān)節(jié)炎協(xié)會(Osteoarthritis Research Society International)改良版評分也同樣提示,治療組與安慰劑組相比,評分明顯改善(p0.05),且與假手術(shù)組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。HE染色結(jié)果提示,在造模術(shù)后60天,安慰劑組的鈣化軟骨明顯增厚超過透明軟骨(p0.05),而治療組與安慰劑組相比降低了鈣化軟骨的厚度(p0.05)。免疫組織化學(xué)染色及熒光染色結(jié)果提示,模型組lubricin表達(dá)明顯減少(p0.05),而在治療組可以看到異甘草素保留了軟骨內(nèi)的lubricin(p0.05)。MMP-13及代表軟骨降解的Ⅹ型膠原在模型組明顯高表達(dá)(p0.05),并與假手術(shù)組有統(tǒng)計學(xué)意義,而在異甘草素治療組表達(dá)明顯下降(p0.05)。2.術(shù)后30天及60天的結(jié)果提示,安慰劑組BV/TV(%)在術(shù)后30天,60天都有明顯的下降(p0.05),而異甘草素治療組保留了軟骨下骨的骨量(p0.05)。另外,和安慰劑組相比,異甘草素降低了骨小梁模式因子(p0.05),增加了軟骨下骨板的厚度(p0.05),這些指標(biāo)與假手術(shù)組相比沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。安慰劑組軟骨下骨髓腔內(nèi)TRAP+的破骨細(xì)胞明顯增多,這與Micro-CT結(jié)果相一致。而異甘草素治療組明顯降低了TRAP+的破骨細(xì)胞。同時,我們觀察到安慰劑組Osterix陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(p0.05)且聚在軟骨下骨骨髓腔,而并沒有遷移到骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收。而異甘草素治療組減少了髓腔內(nèi)的Osterix陽性細(xì)胞(p0.05)并可以看到少有的Osterix陽性位于骨形成的邊緣并未位于髓腔內(nèi)。在安慰劑組中,RANKL及TRAF6在軟骨髓腔內(nèi)共表達(dá)明顯升高(p0.05),而這一升高被異甘草素所抑制,并與假手術(shù)組并沒有明顯差異(p0.05)。ELISA測定了小鼠外周血中破骨細(xì)胞骨吸收的標(biāo)記物CTXⅠ,發(fā)現(xiàn)三組之間該指標(biāo)并沒有明顯的差異(p0.05)。3.安慰劑組中的nestin+間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增多(p0.05),而異甘草素降低了nestin+間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá),并與假手術(shù)組沒有明顯的差異。在安慰劑組中,p Smad2/3陽性的細(xì)胞明顯增多(p0.05)。而異甘草素明顯降低了這種異常高表達(dá)的p Smad2/3(p0.05)。我們對小鼠0天,7天,14天,30天的樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)p Smad2/3陽性的細(xì)胞與TRAP+破骨細(xì)胞的變化趨勢相一致。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信號通路探究異甘草素對早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨異常血管形成的影響:1.Micro-CT掃描結(jié)果提示,在術(shù)后30天時,安慰劑組軟骨下骨的血管數(shù)量及體積與假手術(shù)組相比明顯增多(p0.05),而異甘草素減低了這種異常增加的顯微血管(p0.05)。2.在安慰劑組中,CD3l+和Endomucin+共表達(dá)陽性明顯增多(p0.05),而異甘草素明顯降低了CD3l+和Endomucin+的表達(dá)(p0.05)。說明異甘草素對H型血管有明顯的抑制作用。3.通過免疫熒光染色證實,在術(shù)后30天,安慰劑組中軟骨下骨內(nèi)MMP-2表達(dá)明顯升高(p0.05),但異甘草素降低了異常高表達(dá)的MMP-2并與假手術(shù)組相比,沒有明顯差異。結(jié)論:(1)1.異甘草素通過下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)的NF-κB通路,抑制了IL-1β刺激下軟骨細(xì)胞的凋亡及降解。(2)異甘草素通過下調(diào)軟骨下骨RANKL-RANK-TRAF6通路直接抑制TRAP+破骨細(xì)胞的分化,降低破骨細(xì)胞骨吸收,間接減少有活性的TGF-β1的釋放,從而降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)p Smad2/3通路的表達(dá),阻止其異常的遷移及異位成骨,最終抑制異常的軟骨下骨骨重建,維持軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu),保證了正常的應(yīng)力分布從而保護(hù)上層的關(guān)節(jié)軟骨。(3)異甘草素通過直接抑制MMP-2的表達(dá),間接抑制TGF-β信號通路,從而降低異常顯微血管的形成來調(diào)節(jié)軟骨下骨的骨重塑,抑制異常的骨形成,維持軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu)并最終緩解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
【圖文】：

圖 2-1 實驗技術(shù)路線圖Fig. 2-1 Roadmap of Experimental Technology 一般細(xì)胞培養(yǎng).1 細(xì)胞復(fù)蘇備 10ml 移液管，完全培養(yǎng)基，T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，恒溫水浴鍋，15ml 離氏管備超凈臺，放置完全培養(yǎng)基，移液管，提前打開 15ml 離心管蓋，T25在臺上備用。備好水浴鍋至 37℃。液氮罐中取出細(xì)胞，迅速至預(yù)熱好的水浴鍋，不停快速晃動，加速融全化后用巴氏管吹打均勻，吸出至 15ml 離心管。離心管內(nèi)緩慢滴加完全培養(yǎng)基 5ml，吹打均勻后 1000 轉(zhuǎn)，5 分鐘離心心后，棄上清液，重復(fù)以上步驟再次緩慢滴加完全培養(yǎng)基 5ml，，吹打

S 誘導(dǎo)第 0 天，7 天，14 天，21 天行 1%阿爾新藍(lán)染色驗證 ATDrentiation of ATDC5 cell was determined by 1% Alcian blue stai21day-PCR 測定軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白及Ⅹ型膠選用實時熒光定量 PCR 技術(shù)測定軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原，結(jié)果提示：Ⅱ型膠原蛋白（COL Ⅱ）在加入 ITS 誘導(dǎo)高，到 14 天達(dá)到表達(dá)峰值，這提示著 ATDC5 細(xì)胞系向誘導(dǎo)至 21 天時，有所下降。但Ⅹ型膠原蛋白的 mRNA導(dǎo)至 21 天時表達(dá)量超過Ⅱ型膠原蛋白達(dá)到峰值。這提化的晚期階段，軟骨細(xì)胞逐漸變的肥大，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯增加（圖 2-3）。根據(jù)以上結(jié)果說明，ITS 誘導(dǎo)熟軟骨細(xì)胞形成。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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