【摘要】：第一部分從ER-α/PI3K/Akt信號通路探討胡蘆巴丸活性組分改善HepG2細胞胰島素抵抗的機理研究目的比較胡蘆巴丸活性組分薯蕷皂苷元(DSG)、補骨脂素(5-MOP)以及薯蕷皂苷元和補骨脂素(DSG/5-MOP)對人肝癌細胞(HepG2)胰島素抵抗細胞模型的影響,并探索其相關分子機制。方法采用10-6mol/L胰島素干預HepG2細胞36h,建立高胰島素誘導的胰島素抵抗細胞模型。根據所給予相應的藥物干預,分為DSG(10-5mol/L)組、5-MOP(10-6mol/L)組、DSG/5-MOP(10-5 mol/LDSG 和 10-6 mol/L5-MOP)組、雌二醇((β-Estradiol,10-6 mol/L)組,另設模型組和對照組。免疫熒光激光共聚焦觀察雌激素受體-α(ERα)的分布與表達;葡萄糖氧化酶法檢測上清液葡萄糖消耗;蒽酮法測定細胞內糖原含量;Western Blot檢測ERα、src蛋白(3c)、磷酸肌醇-3激酶p85亞單位(P13Kp85)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3-β(GSK-3β)的磷酸化蛋白/總蛋白表達水平,免疫熒光檢測葡萄糖轉運體-4(GLUT-4)的表達。結果免疫熒光激光共聚焦顯微鏡顯示ERα在HepG2細胞的胞膜、胞漿、胞核中均有表達,與對照組比較,模型組細胞內ERα表達降低;與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組ERα表達增加。與對照組比較,模型組細胞內糖原合成、細胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.01,P0.05);與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組細胞內糖原合成、細胞上清葡萄糖消耗顯著增加(P0.01,P0.05),且與DSG組相比,DSG/5-MOP組細胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.05)。與對照組比較,胰島素抵抗細胞模型組的細胞內p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3 表達顯著降低(P0.01,P0.05);與模型組相比,DSG 組、5-MOP 組、DSG/5-MOP 組和 β-Estradiol 組 p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt(β-Estradiol 組 p-Akt/Akt 與模型組相比無顯著性差異)、p-GSK-3β/GSK-3β 表達顯著增加(P0.01,P0.05);與 DSG 組相比,DSG/5-MOP組p-src/src表達顯著增加(P0.01)。與對照組比較,胰島素抵抗模型組細胞內GLUT-4表達顯著降低(P0.01);與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組GLUT-4表達顯著增加(P0.01,P0.05);與5-MOP組相比,DSG/5-MOP組GLUT-4表達顯著降低(P0.05)。結論胡蘆巴丸中的活性組分DSG和5-MOP可能通過ERα介導的PI3K/Akt信號通路激活而改善胰島素抵抗。第二部分從AMPK/ACC/CPT-1A信號通路探討胡蘆巴丸活性組分改善LO2細胞脂代謝紊亂的機理研究目的比較不同濃度DSG(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)對正常人肝細胞(LO2)內脂肪沉積的影響,并探索其相關分子機制。方法用含0.25mmol/L棕櫚酸(PA)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基干預LO2細胞24h,建立高糖高脂誘導的非酒精性脂肪肝的細胞模型;根據所給予相應的藥物干預,分為低劑量 DSG 組(10-7mol/L)、中劑量 DSG 組(10-6mol/L)、高劑量 DSG 組(10-5 mol/L)、A-769662組(AMPK激活劑,10-5 mol/L),另設模型組和對照組。熒光測定細胞內活性氧(ROS)含量、線粒體膜電位(MMP)、培養(yǎng)液中葡萄糖消耗;酶法檢測細胞內甘油三酯(TG)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量,細胞上清液谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨�；D移酶(γ-GT)含量;Western Blot檢測細胞內腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化蛋白/總蛋白表達水平,細胞內脂肪酸合成酶(FAS)、肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1A(CPT-1A)、固醇調控元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)的蛋白表達水平,胞漿細胞色素c(cyc)含量。此外,用AMPK抑制劑Compound C(10-5mol/L)預刺激細胞5h后再給予相應的藥物干預,Western Blot檢測AMPK,ACC的磷酸化蛋白/總蛋白表達水平。結果與對照組相比,ROS在非酒精性脂肪肝細胞模型組細胞內含量升高;與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組ROS含量降低。與對照組相比,非酒精性脂肪肝細胞模型組細胞MMP顯著降低(P0.01)、細胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞MMP顯著升高(P0.01)、細胞上清葡萄糖消耗顯著升高(P0.01,P0.05)。與對照組相比,TG、ALT、AST、y-GT在非酒精性脂肪肝細胞模型組細胞中顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞TG、ALT、AST、γ-GT顯著降低(P0.01,P0.05)。與對照組相比,GSH-PX、SOD、CAT含量在模型組細胞內顯著降低(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞內GSH-PX、SOD、CAT含量顯著升高(P0.01)。與對照組相比,模型組細胞內MDA含量顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞內MDA含量顯著降低(P0.01)。與對照組相比,p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin表達量在非酒精性脂肪肝細胞模型組細胞內顯著降低(P0.01,P0.05);與模型組相比,低劑量DSG組(CPT-1A/β-actin無顯著性)、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞內 p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin 表達量顯著升高(P0.01,P0.05)。與對照組相比,細胞內FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表達量和胞漿中cyc/β-actin含量在非酒精性脂肪肝細胞模型組顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細胞內FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表達量和胞漿中cyc/β-actin含量顯著降低(P0.01,P0.05)。與DSG 組(10-5 mol/L)細胞相比,Compound C/DSG 組(10-5mol/L Compound C + 10-5mol/L DSG)細胞 p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC 表達量顯著降低(P0.01)。結論胡蘆巴丸中的活性組分DSG可以改善高糖高脂誘導的L02細胞內脂質沉積。其機制可能與激活AMPK/ACC/CPT-1A信號通路、增加脂質分解、減少脂質合成、改善氧化應激損傷有關。
【圖文】：

ＨｑｐＧ２細胞膚島素抵抗模型的建立逡逑用ＲＰＭＩ－１６４０培養(yǎng)基的含糖量減去細胞上清液中所測得的葡萄糖含量即為細胞逡逑上清葡萄糖消耗量，，如圖１－１所示，當族島素濃度為ｌ0－６ｍｏｌ／Ｌ時，細胞上清中葡萄逡逑糖消耗明顯低于對照沮，差異有統(tǒng)計學意義。故選取１０－６ｍｏＩ／Ｌ的膜島素作為最適宜逡逑造模濃度。逡逑０．６－｜逡逑

本文編號：2677693