【摘要】：第一部分從ER-α/PI3K/Akt信號通路探討胡蘆巴丸活性組分改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)理研究目的比較胡蘆巴丸活性組分薯蕷皂苷元(DSG)、補(bǔ)骨脂素(5-MOP)以及薯蕷皂苷元和補(bǔ)骨脂素(DSG/5-MOP)對人肝癌細(xì)胞(HepG2)胰島素抵抗細(xì)胞模型的影響,并探索其相關(guān)分子機(jī)制。方法采用10-6mol/L胰島素干預(yù)HepG2細(xì)胞36h,建立高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞模型。根據(jù)所給予相應(yīng)的藥物干預(yù),分為DSG(10-5mol/L)組、5-MOP(10-6mol/L)組、DSG/5-MOP(10-5 mol/LDSG 和 10-6 mol/L5-MOP)組、雌二醇((β-Estradiol,10-6 mol/L)組,另設(shè)模型組和對照組。免疫熒光激光共聚焦觀察雌激素受體-α(ERα)的分布與表達(dá);葡萄糖氧化酶法檢測上清液葡萄糖消耗;蒽酮法測定細(xì)胞內(nèi)糖原含量;Western Blot檢測ERα、src蛋白(3c)、磷酸肌醇-3激酶p85亞單位(P13Kp85)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3-β(GSK-3β)的磷酸化蛋白/總蛋白表達(dá)水平,免疫熒光檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4(GLUT-4)的表達(dá)。結(jié)果免疫熒光激光共聚焦顯微鏡顯示ERα在HepG2細(xì)胞的胞膜、胞漿、胞核中均有表達(dá),與對照組比較,模型組細(xì)胞內(nèi)ERα表達(dá)降低;與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組ERα表達(dá)增加。與對照組比較,模型組細(xì)胞內(nèi)糖原合成、細(xì)胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.01,P0.05);與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組細(xì)胞內(nèi)糖原合成、細(xì)胞上清葡萄糖消耗顯著增加(P0.01,P0.05),且與DSG組相比,DSG/5-MOP組細(xì)胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.05)。與對照組比較,胰島素抵抗細(xì)胞模型組的細(xì)胞內(nèi)p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3 表達(dá)顯著降低(P0.01,P0.05);與模型組相比,DSG 組、5-MOP 組、DSG/5-MOP 組和 β-Estradiol 組 p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt(β-Estradiol 組 p-Akt/Akt 與模型組相比無顯著性差異)、p-GSK-3β/GSK-3β 表達(dá)顯著增加(P0.01,P0.05);與 DSG 組相比,DSG/5-MOP組p-src/src表達(dá)顯著增加(P0.01)。與對照組比較,胰島素抵抗模型組細(xì)胞內(nèi)GLUT-4表達(dá)顯著降低(P0.01);與模型組相比,DSG組、5-MOP組、DSG/5-MOP組和β-Estradiol組GLUT-4表達(dá)顯著增加(P0.01,P0.05);與5-MOP組相比,DSG/5-MOP組GLUT-4表達(dá)顯著降低(P0.05)。結(jié)論胡蘆巴丸中的活性組分DSG和5-MOP可能通過ERα介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路激活而改善胰島素抵抗。第二部分從AMPK/ACC/CPT-1A信號通路探討胡蘆巴丸活性組分改善LO2細(xì)胞脂代謝紊亂的機(jī)理研究目的比較不同濃度DSG(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)對正常人肝細(xì)胞(LO2)內(nèi)脂肪沉積的影響,并探索其相關(guān)分子機(jī)制。方法用含0.25mmol/L棕櫚酸(PA)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基干預(yù)LO2細(xì)胞24h,建立高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的細(xì)胞模型;根據(jù)所給予相應(yīng)的藥物干預(yù),分為低劑量 DSG 組(10-7mol/L)、中劑量 DSG 組(10-6mol/L)、高劑量 DSG 組(10-5 mol/L)、A-769662組(AMPK激活劑,10-5 mol/L),另設(shè)模型組和對照組。熒光測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量、線粒體膜電位(MMP)、培養(yǎng)液中葡萄糖消耗;酶法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量,細(xì)胞上清液谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)含量;Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化蛋白/總蛋白表達(dá)水平,細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成酶(FAS)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1A(CPT-1A)、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的蛋白表達(dá)水平,胞漿細(xì)胞色素c(cyc)含量。此外,用AMPK抑制劑Compound C(10-5mol/L)預(yù)刺激細(xì)胞5h后再給予相應(yīng)的藥物干預(yù),Western Blot檢測AMPK,ACC的磷酸化蛋白/總蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比,ROS在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型組細(xì)胞內(nèi)含量升高;與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組ROS含量降低。與對照組相比,非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型組細(xì)胞MMP顯著降低(P0.01)、細(xì)胞上清葡萄糖消耗顯著減少(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞MMP顯著升高(P0.01)、細(xì)胞上清葡萄糖消耗顯著升高(P0.01,P0.05)。與對照組相比,TG、ALT、AST、y-GT在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型組細(xì)胞中顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞TG、ALT、AST、γ-GT顯著降低(P0.01,P0.05)。與對照組相比,GSH-PX、SOD、CAT含量在模型組細(xì)胞內(nèi)顯著降低(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞內(nèi)GSH-PX、SOD、CAT含量顯著升高(P0.01)。與對照組相比,模型組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著降低(P0.01)。與對照組相比,p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin表達(dá)量在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型組細(xì)胞內(nèi)顯著降低(P0.01,P0.05);與模型組相比,低劑量DSG組(CPT-1A/β-actin無顯著性)、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞內(nèi) p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin 表達(dá)量顯著升高(P0.01,P0.05)。與對照組相比,細(xì)胞內(nèi)FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表達(dá)量和胞漿中cyc/β-actin含量在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型組顯著升高(P0.01);與模型組相比,低劑量DSG組、中劑量DSG組、高劑量DSG組、A-769662組細(xì)胞內(nèi)FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表達(dá)量和胞漿中cyc/β-actin含量顯著降低(P0.01,P0.05)。與DSG 組(10-5 mol/L)細(xì)胞相比,Compound C/DSG 組(10-5mol/L Compound C + 10-5mol/L DSG)細(xì)胞 p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC 表達(dá)量顯著降低(P0.01)。結(jié)論胡蘆巴丸中的活性組分DSG可以改善高糖高脂誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/ACC/CPT-1A信號通路、增加脂質(zhì)分解、減少脂質(zhì)合成、改善氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
【圖文】：

ＨｑｐＧ２細(xì)胞膚島素抵抗模型的建立逡逑用ＲＰＭＩ－１６４０培養(yǎng)基的含糖量減去細(xì)胞上清液中所測得的葡萄糖含量即為細(xì)胞逡逑上清葡萄糖消耗量，，如圖１－１所示，當(dāng)族島素濃度為ｌ0－６ｍｏｌ／Ｌ時，細(xì)胞上清中葡萄逡逑糖消耗明顯低于對照沮，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。故選取１０－６ｍｏＩ／Ｌ的膜島素作為最適宜逡逑造模濃度。逡逑０．６－｜逡逑

本文編號：2677693