【摘要】：動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊破裂是心腦血管病死亡的主要原因,而斑塊內(nèi)血管新生易加速斑塊進(jìn)展、誘發(fā)斑塊破裂出血,因此,抑制斑塊血管新生可能是延緩斑塊進(jìn)展、增加斑塊穩(wěn)定性的潛在療法�；钛龇剿幹委烝S有良好療效,其中川芎-赤芍藥對有抗AS的作用,而川芎-赤芍藥對代表性活性成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)、芍藥苷(paeoniflorin,PF)對AS斑塊血管新生的作用尚未見相關(guān)研究。環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)可進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,與微小RNAs(microRNAs,miRNAs)競爭性結(jié)合,作為miRNAs的“海綿”影響miRNAs對靶基因的調(diào)節(jié)作用,而TMP、PF配伍是否可通過調(diào)控circRNAs及相關(guān)靶基因干預(yù)AS斑塊血管新生尚不清楚。1.目的嘗試發(fā)現(xiàn)與AS及血管新生相關(guān)的特異性分子標(biāo)記物,評價TMP、PF配伍對AS斑塊血管新生的作用,并基于circRNAs探討TMP、PF配伍干預(yù)AS斑塊血管新生的分子機(jī)制及靶點(diǎn)。2.方法(1)AS差異表達(dá)circRNAs篩選及血管新生相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于西苑醫(yī)院AS血瘀證患者和健康人的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及文獻(xiàn)檢索結(jié)果,本研究進(jìn)一步篩選與AS相關(guān)的circRNAs,預(yù)測與靶circRNAs對應(yīng)的miRNAs及mRNAs,構(gòu)建與AS及血管新生相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),初步確定與AS及血管新生相關(guān)的circRNAs、miRNAs、mRNAs和靶蛋白。(2)TMP、PF配伍對ox-LDL誘導(dǎo)的血管新生的作用及機(jī)制研究不同濃度的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立體外血管新生模型,HUVECs分為正常組、模型組、TMP組、PF組、TMP+PF組,分別單獨(dú)或配伍給予不同濃度的TMP和PF(10、1、0.1、0.01 μmol/L),給藥24h后MTT檢測細(xì)胞增殖。借助Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法進(jìn)行TMP和PF的協(xié)同作用分析,初步得到TMP、PF配伍最佳藥效比例。然后用TMP、PF及最佳配伍干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs,分為正常組、模型組、TMP組、PF組、TMP+PF組、辛伐他汀組。Ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs,11μmol/LTMP、10μmol/LPF、11μmol/LTMP+10μmol/LPF、1μmol/L辛伐他汀分別干預(yù)24h后,免疫熒光染色檢測血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)表達(dá),MTT法檢測細(xì)胞增殖,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移,細(xì)胞管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成管,ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá),Western Blot檢測VEGF受體2(VEGF receptor2,VEGFR2)、Notch通路相關(guān)蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1)的表達(dá)。(3)基于circRNAs探討TMP、PF配伍干預(yù)AS血管新生的分子機(jī)制及靶點(diǎn)Ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs建立體外血管新生模型,TMP、PF配伍(1μmol/LTMP+10O啨蘭ol/LPF)干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs,實(shí)時定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)檢測篩選獲得的circRNAs的表達(dá),獲得目標(biāo)circRNAs并對其進(jìn)行深入的RNA干擾研究。HUVECs分為正常組、模型組、TMP+PF組、TMP+PF+circRNA干預(yù)(siRNA)組、TMP+PF+circRNA干預(yù)(siRNA)+miRNA干預(yù)(inhibitor)組。用siRNA(100nmol/L)和inhibitor(100nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h、ox-LDL誘導(dǎo)、1μmol/LTMP+10μmol/LPF干預(yù)24h后,MTT法檢測細(xì)胞增殖,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移,細(xì)胞管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成管,qPCR檢測circRNAs、miRNAs、mRNAs表達(dá),Western Blot檢測靶蛋白的表達(dá)。(4)TMP、PF配伍對ApoE-/-小鼠AS斑塊血管新生的作用及機(jī)制研究以C57BL/6J小鼠為正常對照,ApoE-/-小鼠分為模型組、TMP+PF組(低劑量1 mg/kg/d+10mg/kg/d、中劑量2mg/kg/d+20mg/kg/d、高劑量5mg/kg/d+50mg/kg/d、極高劑量10mg/kg/d+100mg/kg/d)、辛伐他汀(2.5mg/kg/d)組、TMP組和PF組,其中TMP組、PF組分別選擇最佳配伍劑量中的用藥劑量。正常組給予普通飼料,其余組給予高脂飼料,喂養(yǎng)2個月后給藥,同時繼續(xù)給予高脂飼料至3個月,全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,HE染色觀察斑塊面積,免疫熒光檢測主動脈CD31和vWF表達(dá)以代表血管密度,ELISA檢測血清VEGF表達(dá),Western Blot檢測主動脈VEGFR2、Notch1、靶蛋白的表達(dá)。3.結(jié)果(1)獲得5個與AS及血管新生相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)從AS患者的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選得到3個circRNAs,分別是circRNA_06206[即軟骨新生刺激因子1的circRNA(circRNA of stimulator of chondrogenesis 1,circSCRG1)]、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0041555;從文獻(xiàn)檢索結(jié)果中得到 2 個 circRNAs,分別是has_circ_0000284和hsa_circ_0003575。構(gòu)建與AS及血管新生相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),得到相關(guān)的靶基因和靶蛋白,用于后續(xù)研究。(2)TMP、PF配伍可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的體外血管新生Ox-LDL可誘導(dǎo)HUVECs增殖,不同濃度的TMP、PF(10、1、0.1μmol/L)均有抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖的作用(P0.05)。利用協(xié)同作用分析發(fā)現(xiàn),與其他配伍比例相比,TMP和PF在1:10配伍干預(yù)時有較好的協(xié)同效應(yīng)和量效關(guān)系,在大多數(shù)Fa水平下CI值均小于1,且1 μmol/L TMP和10μmol/L PF的作用最明顯,因此選取TMP和PF的配伍比例1:10進(jìn)行后續(xù)研究。研究發(fā)現(xiàn)TMP、PF配伍(1 μmol/L TMP+10μmol/LPF)、辛伐他汀(1μmol/L)均可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移、成管,降低血管新生相關(guān)蛋白CD31、VEGF、VEGFR2和Notch1表達(dá)水平(P0.05),對vWF表達(dá)無顯著影響(P0.05);TMP、PF配伍還可降低Jagged1和Hes1表達(dá)水平(P0.05),而TMP、PF單獨(dú)使用對Jagged1和Hes1表達(dá)無顯著影響(P0.05)。研究初步表明TMP、PF配伍可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的體外血管新生,其機(jī)制可能與抑制VEGF通路和Notch通路有關(guān)。(3)TMP、PF配伍可能通過調(diào)控circSCRG1發(fā)揮抑制血管新生作用Ox-LDL誘導(dǎo)后circSCRG1表達(dá)水平降低、hsa_circ_0003575表達(dá)水平升高,TMP、PF配伍可升高circSCRG1表達(dá)水平(P0.05),因此選擇circSCRG1進(jìn)行后續(xù)的干擾研究。結(jié)果顯示,TMP、PF配伍可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移、成管,降低核受體4A1(Nuclear receptor4A1,NR4A1)蛋白表達(dá)水平(P0.05),給予circSCRG1的siRNA干預(yù)后TMP、PF配伍未表現(xiàn)出抗血管新生作用,未能降低NR4A1表達(dá)水平(P0.05),而給予hsa-miR-1268b抑制劑干預(yù)后,TMP、PF配伍又表現(xiàn)出抗血管新生作用。因此,TMP、PF配伍抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管新生的作用可能是通過調(diào)控circSCRG1,進(jìn)而調(diào)節(jié)hsa-miR-1268b的靶蛋白NR4A1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。(4)TMP、PF配伍可抑制斑塊血管新生而抗ASAS模型小鼠體重升高,血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平升高,HDL-C水平降低(P0.05);主動脈CD31、vWF、VEGFR2、NR4A1表達(dá)水平升高,缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶2(hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase 2,PHD2/EGLN1)、SAM和SH3包含結(jié)構(gòu)域1(SAM and SH3domain containing1,SASH1)表達(dá)水平降低(P0.05);斑塊內(nèi)新生血管密度增多,斑塊面積增大(P0.05)。TMP、PF配伍高劑量、辛伐他汀均可降低小鼠體重和血清TG水平,減小斑塊面積與管腔面積比值,降低主動脈CD31表達(dá)水平而減少斑塊內(nèi)新生血管密度(P0.05);TMP、PF配伍高劑量還可降低血清LDL-C水平,降低主動脈VEGFR2、靶蛋白NR4A1表達(dá)水平(P0.05)。因此,TMP、PF配伍可能通過抑制斑塊血管新生而發(fā)揮抗AS的作用,其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能為VEGFR2和NR4A1。4.結(jié)論TMP、PF配伍可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs體外血管新生及ApoE-/-小鼠主動脈斑塊血管新生,發(fā)揮抗AS的作用;其抗血管新生的分子機(jī)制可能與調(diào)控circSCRG1進(jìn)而調(diào)節(jié)hsa-miR-1268b的靶蛋白NR4A1表達(dá)、抑制VEGF/VEGFR2通路有關(guān)。
【圖文】：

ＭＡＰＫ）通路、細(xì)胞夕卜信號調(diào)節(jié)激酶通路（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ，邋ＥＲＫ）逡逑等相互作用共同參與血管新生的調(diào)控因而血管新生是多因子、多通路緊密聯(lián)系、逡逑互相調(diào)控的過程（圖１）。逡逑ＶＥＧＦ邐ＶＥＧＦ逡逑、Ｎｏｘ４邐ＣＲＰ邐ＩＬ－８、ＩＬ－１邐ＭＭＰ逡逑ＨＩＦ－ｌｏｔ邐？Ｆ－ｎ邐ＶＣＡＭ－１逡逑１１邋Ｉ１）邐ｉ邐ｉ＇ｉ邋ｒｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｔ邋１１邋ｎ邋１１邋（１１１１１邋１１邋１１邋（ｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｉ邋ＩＩ邋ｉ邋ｊ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｒ＇ｉ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｉｉ邋１１邋ｍ邋ｉｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｉ邋ｉ邋（ｉ邋ｎ邋ｉｉ邋１１邋ｒ邋ｉ邋ｒｉ邋１１邋１１１１邋ｍｉｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋Ｉｔ逡逑ＩＩ邋｜邋｜邐ｉｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐ｌ邐ＩＩ邐ｌ．＿！邋�。卞澹卞澹卞澹椋戾澹澹慑澹殄澹戾澹殄澹殄澹坼澹澹慑澹慑澹慑澹慑澹蹋慑澹保卞澹慑澹″澹湾澹斟澹�，邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜，ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉｉ邋Ｉ邋ｉ邋｜邋Ｉ邋ｙ邋）邋｜邋Ｉ，邋｜邋ｉｉ邋ｊ邋ｉ邋１．１邋Ｉ，邋｜邋ｊ．邋ｉ邋１１）１１１邋ｌ邋ｉ邋Ｍ邋ｉ邋ｌ邋Ｉ邋ｌ邋ＩＪ邋Ｕ，邋！■邋１逡逑Ｊａｇｇｅｄ邋１邋ＳＨＣ邐ｐｉ３ｋ邐ＰＬＣｙ邐Ｓｒｃ逡逑N邐丨邐＾邐Ｉ逡逑Ｎｏｔｃｈ邋Ｒａｓ邐ｉ邐ＰＫＣ邐ＩＰ３

圖２邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ研究；趨勢逡逑ｃＲＮＡｓ的起源與功能逡逑ｉｒｃＲＮＡｓ是由外顯子或內(nèi)含子環(huán)化而成的，，不具有５＇端帽子和３＇端ｐｏｌｙ（Ａ）尾ｉｒｃＲＮＡｓ通過非經(jīng)典剪接方式反向剪接形成，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞中ｃｉｒｃＲＮＡｓＲＮＡｓ邋（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍＲＮＡ，邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡｓ）反向剪接而成［４】。通過不同方式剪接^uＲＮＡｓ邋主要有三種類型：外顯子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ、內(nèi)含子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ（ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ｉｎｔｒｏｎｉｃ邋ＲＮｓ）、外顯子－內(nèi)含子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ（ｅｘｏｎ－ｉｎｔｒｏｎ邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ，ＥＩｃｉＲＮＡｓ）。外顯子邋ｃｉｒｃＲＮ－ｍＲＮＡｓ反向剪接而成，有套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化兩種模型，胞質(zhì)中；ｃｉＲＮＡｓ由內(nèi)含子獨(dú)立環(huán)化形成，主要存在于細(xì)胞核中；ＥＩｃｉＲＮＡｓ外顯子中間保留了內(nèi)含子目前研究發(fā)現(xiàn)大部分的ｃｉｒｃＲＮＡｓ由外顯子序３）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2673003