【摘要】：選題依據(jù):農(nóng)藥殘留,指的是農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。中藥材中農(nóng)藥殘留問題目前已成為制約中藥安全用藥及出口的一大因素。在各類農(nóng)殘的脫除方法中,理化方法由于去除效果差或二次殘留等缺點(diǎn)不適用于藥材中農(nóng)殘的脫除,基于基因工程技術(shù)的生物酶降解法由于能夠很好解決多種農(nóng)殘共存留問題,同時降解效率高且不破壞中藥材的外形等優(yōu)勢,將成為一種新興、綠色的中藥材農(nóng)藥脫除方法。昆蟲解毒酶主要參與昆蟲體內(nèi)各類物質(zhì)的代謝解毒,前期研究表明羧酸酯酶(Carboxylesterase,Ces)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)可參與多種農(nóng)藥的體內(nèi)解毒過程。黃芪來源于蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge的干燥根,具有補(bǔ)氣固表,利尿消腫,斂瘡生肌等功效。其作為山西省主要道地藥材之一,已經(jīng)成為山西中藥材行業(yè)的經(jīng)濟(jì)支柱之一。黃芪為根類藥材,殘留于土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥很容易浸入根部,而有機(jī)氯農(nóng)藥又極難降解。2015版《中國藥典》第一部中專門對黃芪農(nóng)殘限量做出規(guī)定。課題組經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)黃芪存在一定的農(nóng)藥殘留問題。因此,開展以黃芪為載體的根類藥材農(nóng)殘脫除方法研究對于未來黃芪的安全用藥具有重要的科學(xué)意義�；谏鲜霈F(xiàn)狀,本課題旨在篩選能夠高效代謝農(nóng)藥的昆蟲羧酸酯酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶,并以黃芪為載體探究生物酶對藥材農(nóng)殘降解的應(yīng)用可行性,為藥材農(nóng)殘脫除提供新的思路與方法。目的:通過體外過表達(dá),UPLC及體內(nèi)敲除等技術(shù)篩選飛蝗(Locusta migratoria)體內(nèi)具有高效農(nóng)藥代謝活性的昆蟲解毒酶;并以黃芪為研究對象探究解毒酶對于藥材表面農(nóng)藥殘留的代謝效率并評價解毒酶對黃芪指標(biāo)性成分含量的影響。方法:(1)采用Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對飛蝗羧酸酯酶LmCesA1進(jìn)行體外真核表達(dá),并對其進(jìn)行酶學(xué)特性及最適反應(yīng)條件分析;采用大腸桿菌對飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶3種LmGSTs進(jìn)行體外原核表達(dá)并檢測其最適反應(yīng)條件;(2)通過UPLC方法檢測四種飛蝗解毒酶對馬拉氧磷、馬拉硫磷、p,p’-DDT和溴氰菊酯的體外代謝活性;(3)通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)沉默飛蝗體內(nèi)相關(guān)LmGSTs基因,并結(jié)合農(nóng)藥生物學(xué)測定實驗檢測飛蝗對農(nóng)藥的敏感度變化,對LmGSTs進(jìn)行體內(nèi)功能驗證;(4)以黃芪作為研究對象,選擇活性最強(qiáng)的LmGSTE4檢測其對于黃芪表面馬拉硫磷的降解效果,并檢測黃芪指標(biāo)性成分之一毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)的含量,進(jìn)而研究LmGSTE4對黃芪藥用成分的影響。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建LmCesA1真核表達(dá)載體,并在Sf9細(xì)胞中表達(dá)出具有活性的蛋白,其大小為60 kDa左右,并通過鎳柱結(jié)合陰離子交換柱純化得到單一的目的條帶;以α-NA和β-NA為底物對其進(jìn)行酶學(xué)特性分析,發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)條件為pH8,27℃左右;體外農(nóng)藥抑制實驗發(fā)現(xiàn)馬拉氧磷對其有明顯的抑制效果;UPLC結(jié)果顯示,在實驗的反應(yīng)體系下,LmCesA1不參與馬拉氧磷、馬拉硫磷和溴氰菊酯的體外代謝;(2)采用大腸桿菌對3種LmGSTs進(jìn)行體外原核表達(dá),通過鎳柱純化在250 mM咪唑洗脫緩沖液中得到單一的目的條帶;以CDNB為底物檢測其最適反應(yīng)條件,結(jié)果顯示三個酶的最適pH為pH 6-8,最適溫度范圍為20-30℃;殺蟲劑抑制實驗發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷能夠抑制LmGSTE4和LmGSTS2活性;UPLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)LmGSTE4和LmGSTS2能夠代謝馬拉硫磷,同時LmGSTE4能夠?qū),p’-DDT代謝為p,p’-DDE;(3)RNAi結(jié)合農(nóng)藥的生物學(xué)測定實驗結(jié)果顯示:沉默LmGSTe4和LmGSTs2后飛蝗對馬拉硫磷敏感度顯著升高;沉默LmGSTe4后飛蝗對p,p’-DDT敏感度無明顯變化;(4)將純化的LmGSTE4蛋白應(yīng)用于黃芪表面馬拉硫磷農(nóng)藥的降解能力初探,研究結(jié)果顯示:經(jīng)LmGSTE4處理后馬拉硫磷含量降低28.3%;涂抹LmGSTE4對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量無影響。結(jié)論:本研究通過體內(nèi)體外實驗篩選出能夠高效代謝馬拉硫磷的飛蝗解毒酶LmGSTE4和LmGSTS2,并初步探索了該酶在根類藥材黃芪農(nóng)殘脫除中的應(yīng)用。
【圖文】：

圖 1.1 2007-2016 年中藥材農(nóng)藥殘留研究相關(guān)文章篇數(shù)圖 1.2 2007-2016 年有機(jī)氯農(nóng)藥（A）、有機(jī)磷農(nóng)藥（B）和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（C）殘留的研究現(xiàn)狀知網(wǎng)”網(wǎng)站搜索“中藥材、農(nóng)藥殘留”以及“PubMed

圖 1.2 2007-2016 年有機(jī)氯農(nóng)藥（A）、有機(jī)磷農(nóng)藥（B）和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（C）殘留的研究現(xiàn)狀國知網(wǎng)”網(wǎng)站搜索“中藥材、農(nóng)藥殘留”以及“PubMed”es residue”和“traditional Chinese medicine”，對 2007-2016目進(jìn)行統(tǒng)計篩查。由圖 1.1 可知，中藥材農(nóng)藥殘留研究形勢，與過去的 7 年相比，近 3 年對藥材農(nóng)藥殘留的相關(guān)研究有低谷。與 2013 年研究文章的篇數(shù)（36 篇）相比，2014 年 2015 年雖然相關(guān)文章數(shù)有所增長，但也僅為 22 篇，與 持平。同時分別對中藥材中涉及有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥和究現(xiàn)狀進(jìn)行篩查統(tǒng)計，，結(jié)果見圖 1.2。目前中藥材農(nóng)殘現(xiàn)狀藥材農(nóng)殘相關(guān)研究文章數(shù)目相對往年的研究卻不增反減（2間比例的失衡，值得我們中藥材行業(yè)人員的深思。農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及危害
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R282.710.2

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本文編號：2672952