【摘要】：目的:探討蒼術(shù)麩炒前后主要成分整合藥代動力學行為的差異,以及蒼術(shù)麩炒前后對脾虛大鼠內(nèi)源性代謝物的組成和水平產(chǎn)生的不同影響,從藥代動力學和代謝組學的角度解釋蒼術(shù)麩炒后藥效增強的機理。材料與方法:1.采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立一種快速、專屬、靈敏和準確的大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III及蒼術(shù)苷A的濃度檢測方法。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm,2.1×100 mm),流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫,流速0.3 mL/min,柱溫:40℃。樣品室溫度10℃,進樣量2μL。檢測方式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),采用電噴霧離子源(ESI源),電離電壓為3.00 KV,去溶劑氣溫度為400℃,去溶劑氣流速為800 L/Hr,核心氣體流速為150 L/Hr,霧化氣體壓力為7 bar。方法學驗證參考FDA關(guān)于分析方法驗證指導原則和SFDA對用于藥代動力學研究方法學的要求,考察了精密度和準確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性(室溫穩(wěn)定性、反復(fù)凍融、長期穩(wěn)定性)等參數(shù)。2.以SPF級別的SD大鼠為實驗研究對象,將大鼠隨機分為空白對照組、生蒼術(shù)組、麩炒蒼術(shù)組。生蒼術(shù)組和麩炒蒼術(shù)組分別灌胃給予一定劑量的生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)提取液,對照組給予等量生理鹽水。給藥后0.083,0.016,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12 h大鼠眼眶取血,樣品處理后,采用上述建立的測定方法測定其中各主要成分的血藥濃度,經(jīng)DAS3.0程序處理數(shù)據(jù),比較生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)中主要成分的藥動學參數(shù),繪制藥時曲線,闡明麩炒是否能促進指標成分的吸收,提高其生物利用度;并根據(jù)蒼術(shù)中各成分曲線下面積(AUC_(0-t)),計算白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III及蒼術(shù)苷A在大鼠血漿中的綜合血漿濃度,進一步估算這四種成分的整合藥代動力學參數(shù)。3.本文以SPF級別的SD大鼠為實驗研究對象,將SD大鼠隨機分為正常組、模型組、生蒼術(shù)組和麩炒蒼術(shù)組,采用飲食不節(jié)、過度疲勞及苦寒泄瀉的方法造成大鼠脾虛模型,選用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測定各組大鼠生化指標VIP、SS、SP和SDH的含量,并比較各組間含量差異;采用液質(zhì)聯(lián)用代謝組學分析方法,并結(jié)合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA),對脾虛模型組與正常對照組代謝產(chǎn)物進行比較,尋找脾虛差異性代謝產(chǎn)物。4.運用液質(zhì)聯(lián)用代謝組學分析方法,結(jié)合OPLS-DA模式識別技術(shù)分析蒼術(shù)麩炒前后對脾虛大鼠血漿中差異性代謝物的影響,確認生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)作用的差異性代謝產(chǎn)物。結(jié)果:1.實驗結(jié)果顯示,建立的UPLC/MS-MS方法具有較高的特異性和靈敏度,可應(yīng)用于同時測定灌胃蒼術(shù)提取物后大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)苷A的濃度。4種被測成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,精密度和穩(wěn)定性等均符合要求。2.SD大鼠灌胃生蒼術(shù)提取液后,測得大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)苷A的最大血藥濃度Cmax分別為32.088±2.05 ng/mL、49.616±7.692 ng/mL、87.041±17.025 ng/mL和57.80±21.65 ng/mL;大鼠灌胃麩炒蒼術(shù)提取液后,測得大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)苷A的最大血藥濃度Cmax分別為66.94±10.89 ng/mL、55.9±13.58 ng/mL、113.10±19.04 ng/mL和69.38±8.29 ng/mL。蒼術(shù)經(jīng)麩炒后,白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)苷A的最大血藥濃度均有不同程度的升高;整合藥代動力學結(jié)果顯示灌胃生蒼術(shù)提取液和麩炒蒼術(shù)提取液后,最大血藥濃度Cmax分別為54.17±7.16 ng/mL和70.02±5.16ng/mL。3.與正常組相比,模型組血清中VIP、SS、SP和SDH的含量均下降;與模型組相比,生蒼術(shù)組與麩炒蒼術(shù)組血清中VIP、SS、SP和SDH的含量均升高,且麩炒蒼術(shù)的效果要優(yōu)于生蒼術(shù)。代謝組學研究結(jié)果顯示,與正常組相比較,脾虛大鼠血漿中共篩選出17種對分類有顯著貢獻的脾虛差異性代謝產(chǎn)物,其中正模式下發(fā)現(xiàn)9種,分別是糖原、油酸、煙酸、磷脂酰膽堿、磷酸肌醇、二氫葉酸、膽固醇、4’-磷酸泛酸巰基乙胺和N2-Succinylglutamic acid;負模式下發(fā)現(xiàn)8種,分別是棕櫚酰左旋肉堿、磷酸核糖胺、N-軟脂�；劝彼�、N-乙酰-氨基葡萄糖、丙氨酸、L-山梨糖、葡糖-6-磷酸和5-甲基胞嘧啶。并通過對與這些脾虛差異代謝物相關(guān)代謝通路的分析發(fā)現(xiàn),脾虛的發(fā)生機制與氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝等密切相關(guān)。4.生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對上述篩選出的差異性代謝產(chǎn)物均具有正向調(diào)節(jié)作用,其中對二氫葉酸、4’-磷酸泛酸巰基乙胺、磷脂酰膽堿、磷酸肌醇、油酸、棕櫚酰左旋肉堿、磷酸核糖胺、葡糖-6-磷酸、煙酸和丙氨酸的調(diào)節(jié)作用,麩炒蒼術(shù)要優(yōu)于生蒼術(shù)。結(jié)論:1.通過比較生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)中主要成分白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)苷A的最大血藥濃度可知,給藥麩炒蒼術(shù)提取液后大鼠血漿中這四種成分的最大血藥濃度均有所升高,表明麩炒可促進蒼術(shù)中主要成分的吸收。2.通過代謝組學研究可知,生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)均對不飽和脂肪酸代謝途徑,葡萄糖-丙氨酸循環(huán),棕櫚酰左旋肉堿代謝途徑,氨基葡萄糖代謝,磷脂酰膽堿代謝,磷酸肌醇代謝等途徑有調(diào)節(jié)作用,且麩炒蒼術(shù)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于生蒼術(shù)。
【圖文】：

(E)圖 1-2 五種化合物的質(zhì)譜圖A），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（B），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（C），蒼術(shù)苷 A（D），對乙酰術(shù)和麩炒蒼術(shù)粉末各 100g（過 50 目篩），，加 10 倍量蒸餾水將藥液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，T=65℃，N=45r/min，濃縮至一ml 的生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)提取物。品系列、質(zhì)量控制樣品（QC）及內(nèi)標溶液的配制品溶液的配制：精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ3.5mg，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ5.0術(shù)苷 A 4.3mg，置于 100mL 容量瓶中，加適量甲醇溶解定容酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和蒼術(shù)苷 A 分別為 35μg/mL3μg/mL 的混合對照品儲備液，于 4℃下保存?zhèn)溆�。、高三個濃度的混合對照品溶液，氮氣流下吹干，加入一定

圖 1-3 血漿樣品中白術(shù)內(nèi)酯ⅠUPLC- MS/MS 色譜圖白血漿（A）；空白血漿加白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（3.2 ng/mL）（B）； 灌胃生蒼術(shù) 1.5h 后血漿（C）； 胃麩炒蒼術(shù) 1.5h 后血漿（D）1：白術(shù)內(nèi)酯 ⅠA2B
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2673050