【摘要】：研究背景:血管內(nèi)皮細胞衰老是血管衰老、心血管疾病主要的危險因素之一。在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中,中藥材黃芪被用于治療心血管疾病已有2000多年的歷史。黃芪多糖是黃芪的主要提取物之一,最近的藥理學研究顯示,它具備多種生物學功能并具有一定的血管保護作用。方法:從大鼠主動脈提取并體外培養(yǎng)原代內(nèi)皮細胞以備實驗研究,使用CD31及vWF免疫熒光、流式細胞術、低密度脂蛋白攝取、管形成、CCK8、Hoechst染色等技術鑒定內(nèi)皮細胞并評價內(nèi)皮細胞的功能活性。利用高糖誘導建立內(nèi)皮細胞衰老模型,觀察黃芪多糖對血管內(nèi)皮細胞P16、P21等衰老指標、線粒體鈉鈣交換蛋白(NCLX)表達的影響,siRNA抑制NCLX表達后再次觀察黃芪多糖對內(nèi)皮細胞表達P16等衰老指標、IL-1等炎癥指標的影響。siRNA抑制NCLX表達前后分別觀察黃芪多糖對內(nèi)皮細胞LC3B等自噬指標的影響,電鏡觀察自噬體。結果:1)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞提取和原代培養(yǎng)成功,純度高達94.65%。體外傳至第10代仍有穩(wěn)定的成管、增殖等功能,且未見傳代后的內(nèi)皮細胞中存在衰老相關的β-半乳糖苷酶染色顯著陽性的細胞。2)黃芪多糖可以抑制高糖所誘導的主動脈內(nèi)皮細胞中衰老相關蛋白P16、P21、P53的表達。3)黃芪多糖增強衰老內(nèi)皮細胞中NCLX的表達。4)下調(diào)NCLX可抑制黃芪多糖的抗衰老作用并增加NLRP3、IL-1炎癥因子的表達。5)黃芪多糖可促進細胞LC3BⅠ向LC3BⅡ轉化,自噬相關蛋白Atg7聚集增多,使p62/SQSTM 1減少,形成自噬體。結論:本研究開發(fā)了 一種從大鼠主動脈中分離和培養(yǎng)高純度的、具有良好功能的血管內(nèi)皮細胞的新方法,無需膠原酶消化,且體外培養(yǎng)至第10代細胞仍具有功能。黃芪多糖具有延緩血管內(nèi)皮細胞衰老、抑制炎癥的作用,且該作用可能依賴于NCLX的調(diào)節(jié)。黃芪多糖可通過LC3-p62-Atg7促進自噬體形成,保證自噬通量,這可能是其延緩血管內(nèi)皮細胞衰老的機制之一。
【圖文】：

將胸主動脈從大鼠體中分離，體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞。從形態(tài)學上看，在基質(zhì)膠逡逑包被的細胞培養(yǎng)板上主動脈組織段遷移出梭形細胞，培養(yǎng)５０－７２小時后內(nèi)皮細胞沿條逡逑索狀排列形成管狀（圖１－１Ａ）。主動脈組織段在無基質(zhì)膠包被的細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)時，逡逑觀察到在５０－７２小時后有細胞從主動脈周圍爬出，，呈短梭形或者類三角形，約９６小逡逑時后，它們沿著胸主動脈段呈單層鋪路石狀排列（圖１－１Ｂ）。培養(yǎng)７－１０天后，細胞覆逡逑蓋了約三分之二的細胞培養(yǎng)皿，但在培養(yǎng)皿上分布不均。逡逑W悘逡逑圖ｌ－ｉ，大鼠主動脈內(nèi)皮細胞逡逑圖Ａ，用基質(zhì)膠包被的細胞培養(yǎng)板體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，第５０－７２小時，分布呈條索狀。圖Ｂ，逡逑無基質(zhì)膠包被的六孔板培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，約第９６小時，從大鼠主動脈段遷移出來的內(nèi)皮細胞呈逡逑單層鋪路石狀排列。逡逑二、邐大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的純度逡逑免疫熒光檢測第三代內(nèi)皮細胞表達的ＰＥＣＡＭ－１邋（ＣＤ３１，圖１－２Ａ）和ｖｏｎ逡逑Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ

通過ＣＣＫ８、管形成試驗和Ｐ－半乳糖苷酶染色等評價原代大鼠主動脈內(nèi)皮細胞在逡逑體外的活性和功能，以及傳代培養(yǎng)的影響。Ｐ３、Ｐ１０內(nèi)皮細胞使用Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８染逡逑色（圖１－３Ａ），均未見到明顯的凋亡細胞（細胞核呈碎塊狀、致密濃染、發(fā)白）。用ＣＣＫ－８逡逑法分別在第３和第１０代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的１－５天檢測細胞增殖情況，結果可見，第３逡逑和第１０代內(nèi)皮細胞數(shù)量增長趨勢大致相同，總體生長速度相似，無顯著差異（圖逡逑１－４Ｂ）。并且，原代培養(yǎng)的第３代、第１０代內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠上培養(yǎng)６小時，均可見逡逑管狀結構的形成，驗證了此內(nèi)皮細胞在一定的體外培養(yǎng)條件下仍具有成管的能力（圖逡逑１５逡逑
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2612086