【摘要】：目的:職業(yè)性矽塵暴露可導(dǎo)致矽肺病,特征性表現(xiàn)為慢性炎癥、組織修復(fù)異常和不可逆轉(zhuǎn)的肺纖維化。由于矽肺發(fā)病機制仍不明確、有效的臨床療法尚待發(fā)現(xiàn),尋找特異性分子靶點和經(jīng)濟有效的藥物仍然是職業(yè)病防治工作中尚待解決的關(guān)鍵問題。肺泡巨噬細胞是矽肺發(fā)病過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用的細胞之一。我們之前的研究曾證實天然單體——薯蕷皂苷可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞主導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)而對矽肺治療發(fā)揮積極作用,然而其具體分子機制有待進一步探索。本研究意在深入探討薯蕷皂苷調(diào)控巨噬細胞影響矽塵所致肺部炎癥和纖維化的可能機制,以期為矽肺治療提供有效依據(jù)。研究方法:通過非暴露方式經(jīng)氣管灌注晶體二氧化硅建立實驗性矽肺小鼠模型,應(yīng)用Realtime-PCR和免疫印跡法,檢測矽塵暴露早期(7天)和晚期(56天)實驗性矽肺模型小鼠肺組織中自噬相關(guān)基因和蛋白變化情況;通過建立MH-S細胞體外矽塵暴露模型,并分別給予自噬激活劑或抑制劑,使用流式細胞術(shù)和TUNEL法,驗證自噬對肺泡巨噬細胞凋亡的影響;用生物信息學(xué)軟件預(yù)測薯蕷皂苷的可能生物效應(yīng),并通過構(gòu)建LC3-GFP-mRFP轉(zhuǎn)染巨噬細胞系,動態(tài)觀察薯蕷皂苷對自噬的調(diào)控;同時在體內(nèi)外矽塵暴露模型中,以免疫熒光、免疫印跡和凋亡檢測等方法進一步證實薯蕷皂苷對自噬和凋亡的作用;通過薯蕷皂苷和自噬抑制劑聯(lián)合作用,將薯蕷皂苷對自噬和凋亡的作用相互關(guān)聯(lián)。上述實驗用以說明薯蕷皂苷調(diào)控自噬對矽塵所致的肺泡巨噬細胞凋亡的效應(yīng)。建立Atg5基因沉默MH-S細胞體外矽塵暴露模型和基因敲除鼠(Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+))實驗性矽肺模型,并從體內(nèi)外途徑進行薯蕷皂苷給藥,通過免疫熒光和免疫組化法檢測薯蕷皂苷對線粒體自噬的作用;采用mitoSOX~(TM)染色檢測薯蕷皂苷通過調(diào)控自噬對線粒體ROS含量的影響;采用JC-1、TMRE、Rhodamine123染色檢測薯蕷皂苷通過調(diào)控自噬對線粒體膜電位的影響;通過ATP檢測衡量薯蕷皂苷通過調(diào)控自噬對線粒體功能的影響;通過檢測細胞色素酶c和caspase3/7活性衡量薯蕷皂苷通過調(diào)控自噬對線粒體凋亡途徑激活的影響。上述實驗用以說明薯蕷皂苷調(diào)控自噬對矽塵所致的線粒體損傷的效應(yīng)。ELISA和Realtime-PCR法檢測在轉(zhuǎn)錄和分泌水平對MH-S細胞、肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清及BALF中細胞因子含量進行檢測,同時以Realtime-PCR和免疫印跡法在基因和蛋白水平對MH-S細胞和肺組織中MMPs含量進行檢測,用以薯蕷衡量皂苷通過調(diào)控自噬對巨噬細胞分泌細胞因子的影響;采用免疫組織化學(xué)染色和HE染色法觀察薯蕷皂苷通過調(diào)控細胞自噬對肺組織炎癥的影響;通過Realtime-PCR和天狼星紅染色等方法檢測膠原沉積情況,從而衡量薯蕷皂苷誘導(dǎo)的自噬對矽肺纖維化的影響。上述實驗用以說明薯蕷皂苷調(diào)控自噬對矽塵所致的炎癥和纖維化的效應(yīng)。結(jié)果:1、矽塵暴露小鼠肺組織中自噬增強免疫印記法和Realtime-PCR法檢測矽塵暴露早期和晚期肺組織中自噬相關(guān)蛋白在蛋白水平和基因水平的表達情況。結(jié)果顯示,在矽塵暴露早期和晚期,實驗組小鼠肺組織中表達LC3II、ATG5、BECN1和P62蛋白水平均有增高(P0.05);自噬相關(guān)基因的表達在兩個時間點也有所增加,早期的P62和晚期的Atg5、ULK1及P62基因的變化具有統(tǒng)計學(xué)意義。2、促進自噬可減輕矽塵誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞凋亡運用流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測矽塵暴露環(huán)境中單獨或聯(lián)合給予自噬激活劑、自噬阻斷劑和薯蕷皂苷的MH-S細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,抑制自噬可以增加矽塵所致的MH-S細胞凋亡,促進自噬可以降低矽塵所致的MH-S細胞凋亡(P0.05)。3、薯蕷皂苷通過促進肺泡巨噬細胞自噬減輕細胞凋亡凋亡實驗結(jié)果顯示,給予薯蕷皂苷可以降低細胞凋亡水平,而當(dāng)薯蕷皂苷和自噬抑制劑一同給予時,薯蕷皂苷不能降低細胞凋亡水平。激光共聚焦顯微鏡觀察到給予薯蕷皂苷可以促進MH-S細胞內(nèi)的自噬流;免疫印跡法結(jié)果顯示,相較實驗組,實驗給藥組MH-S細胞的LC3II、BECN1蛋白表達水平增高,P62蛋白表達水平降低,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系(P0.05);實驗給藥組MH-S細胞AKT/mTOR通路磷酸化水平顯著降低,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。免疫印跡法和免疫熒光法分別檢測薯蕷皂苷給藥矽肺模型小鼠肺組織和肺泡巨噬細胞中自噬變化情況:在矽塵暴露的早期和晚期,相較實驗組,實驗給藥組小鼠肺組織和肺泡巨噬細胞的LC3II、BECN1蛋白表達水平增高,P62蛋白表達水平降低,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實驗給藥組小鼠肺泡巨噬細胞中LC3蛋白熒光表達增加,P62蛋白熒光表達減弱。流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測原代肺泡巨噬細胞的結(jié)果顯示,在兩個時間點,薯蕷皂苷給藥均可降低矽塵誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞凋亡(P0.05)。4、薯蕷皂苷促進肺泡巨噬細胞的線粒體自噬免疫印跡法結(jié)果顯示,薯蕷皂苷可以促進MH-S細胞自噬相關(guān)蛋白LC3II、BECN1的表達,減少P62蛋白的表達;同時,薯蕷皂苷可以促進線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1和Parkin的表達,而薯蕷皂苷的作用可以被Atg5基因沉默逆轉(zhuǎn)。免疫熒光結(jié)果顯示,實驗給藥組細胞中的自噬小體標記物L(fēng)C3(紅)和自噬小體與線粒體標記物重合點(黃)的表達均高于實驗組細胞。5、薯蕷皂苷通過調(diào)控自噬保護線粒體功能使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測肺泡巨噬細胞中線粒體ROS的表達情況。結(jié)果顯示,薯蕷皂苷給藥可以緩解矽塵誘導(dǎo)的線粒體ROS高表達,而在Atg5基因沉默細胞中這種作用消失(P0.05)。我們用JC-1探針檢測線粒體膜電位,觀察到薯蕷皂苷以自噬依賴的方式保護線粒體膜電位,減少矽塵造成的線粒體膜電位降低(P0.05)。用TMRE和Rhodamine123染色法檢測線粒體通透性,實驗結(jié)果顯示,薯蕷皂苷會通過促進自噬減輕矽塵造成的線粒體膜通透性增加。采用檢測細胞內(nèi)ATP含量的方法來衡量線粒體功能,薯蕷皂苷可以增強線粒體功能,Atg5基因沉默可以逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的作用(P0.05)。通過獲取Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠矽肺模型肺泡灌洗液中的巨噬細胞,我們檢測體內(nèi)途徑薯蕷皂苷給藥對線粒體功能的影響。與體外途徑給藥實驗結(jié)果相似,薯蕷皂苷可以減少矽塵造成的肺泡巨噬細胞的線粒體ROS高表達、線粒體膜電位降低、線粒體通透性增加和線粒體功能降低,而薯蕷皂苷的這一系列作用無法在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺泡巨噬細胞中發(fā)揮作用(P0.05)。6、薯蕷皂苷抑制線粒體凋亡途徑的激活使用免疫熒光法檢測線粒體凋亡關(guān)鍵蛋白細胞色素酶c的分布,我們觀察到矽塵可造成細胞色素酶c的熒光強度增加并廣泛分布于細胞質(zhì)中,薯蕷皂苷可以限制細胞色素酶的分布,Atg5基因沉默可以逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的作用。Caspase 3/7活性檢測的結(jié)果顯示,薯蕷皂苷可以減輕矽塵誘導(dǎo)的細胞內(nèi)Caspase 3/7活性增加,Atg5基因沉默可以逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的作用(P0.05)。7、薯蕷皂苷通過促進自噬降低肺泡巨噬細胞因子的分泌ELISA法檢測MH-S細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌水平,結(jié)果表明,薯蕷皂苷可以顯著降低矽塵所致的MH-S細胞分泌IL-1β、IL-6和MCP-1水平,而Atg5基因沉默和BECN1基因沉默均可以逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的此種作用(P0.05)。Realtime-PCR法和ELISA法在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測薯蕷皂苷給藥矽肺模型小鼠肺泡巨噬細胞分泌細胞因子的水平。結(jié)果顯示,薯蕷皂苷可以顯著降低肺泡巨噬細胞Il-1β、Il-6和Mcp-1基因的表達和因子的分泌,且都具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌水平不會因給予薯蕷皂苷而降低(P0.05)。8、薯蕷皂苷通過促進自噬降低肺泡巨噬細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌免疫印跡法檢測MH-S細胞中的MMPs的表達水平,結(jié)果表明,薯蕷皂苷可以顯著降低矽塵刺激下MH-S細胞分泌MMP9和MMP12的水平,而Atg5基因沉默可以逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的此種作用(P0.05)。Realtime-PCR法和免疫印跡法在基因和蛋白水平檢測薯蕷皂苷給藥矽肺模型小鼠肺組織中MMPs的表達水平。結(jié)果顯示,薯蕷皂苷可以顯著降低Mmp9和Mmp12基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達,均有統(tǒng)計學(xué)意義。而在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺組織中Mmp9和Mmp12基因轉(zhuǎn)錄水平不會因薯蕷皂苷的給予降低,而模型組Mmp9和Mmp12基因轉(zhuǎn)錄水平比Atg5~(flox/flox)Dppa3~(+/+)小鼠更高(P0.05)。9、薯蕷皂苷通過促進自噬延緩矽肺炎癥和纖維化免疫組織化學(xué)法檢測巨噬細胞在組織中的聚集情況,我們觀察到薯蕷皂苷可以顯著降低矽塵造成巨噬細胞標記F4/80的增加。HE染色檢驗炎細胞浸潤和炎癥損傷情況,我們觀察到薯蕷皂苷可以顯著緩解矽塵造成肺組織損傷,而薯蕷皂苷不能緩解矽塵引起的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠的肺組織炎癥。Realtime-PCR法和天狼星紅染色檢驗?zāi)z原沉積情況,實驗結(jié)果表明,薯蕷皂苷可以顯著緩解矽塵引起的Col1a1和Col3a1基因轉(zhuǎn)錄增加(P0.05)和Ⅰ型和Ⅲ型膠原的的表達。結(jié)論:薯蕷皂苷通過促進肺泡巨噬細胞自噬,增強對矽塵損傷線粒體的清除、減輕線粒體介導(dǎo)凋亡通路的激活,進而使肺泡巨噬細胞抵抗矽塵所致的凋亡,從而減少細胞內(nèi)過量的線粒體ROS產(chǎn)生和巨噬細胞促炎促纖維化因子分泌,以緩解矽塵所致的肺部炎癥和纖維化。
【圖文】：

16圖 3.1 矽塵暴露小鼠肺組織中自噬相關(guān)基因和蛋白的變化情況A：免疫印跡法檢測矽塵暴露早期和晚期各組小鼠肺組織內(nèi) LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 的變化情況。B：矽塵暴露早期 LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 蛋白表達水平統(tǒng)計圖（n=3）。C：矽塵暴露晚期 LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 蛋白表達水平統(tǒng)計圖（n=3）。D：Realtime-PCR 檢測矽塵暴露早期各組小鼠肺組織中 BECN1，Atg5，Atg7，Ulk1 和 P62mRNA 的變化情況（n=5）。E：Realtime-PCR 檢測矽塵暴露晚期各組小鼠肺組織中 BECN1，Atg5，，Atg7，Ulk1 和 P62mRNA的變化情況（n=5）。*，P㩳0.05；**，P㩳0.01。實驗結(jié)果表示為均數(shù)±標準誤（mean±SEM）。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文進 MH-S 細胞自噬可減輕矽塵所致細胞凋亡巨噬細胞在矽肺病程中起關(guān)鍵作用。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，矽肺自噬活動發(fā)生改變[21]。細胞自噬與細胞凋亡密切相關(guān)[22]，而肺泡影響矽肺病的發(fā)生發(fā)展[23]。為進一步探究自噬在肺泡巨噬細胞凋引入肺泡巨噬細胞系 MH-S，在給予矽塵（CS,50μg/cm2）模擬暴噬誘導(dǎo)劑——雷帕霉素（Rapamycin）、自噬抑制劑——3MA、Co)單獨或聯(lián)合處理細胞后檢驗凋亡情況。生物信息學(xué)分析表明，薯噬過程（圖 3.2），且前期研究證實其對矽肺有治療作用，我們假藥物。幾種藥物的用量均經(jīng)過 MTT 實驗和 PI-Annexin V 實驗驗力和凋亡（圖 3.3）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任春霞;;矽塵作業(yè)工人767例心電圖結(jié)果分析[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2017年03期

2 杜影;田宏飛;安玉;;某鑄造企業(yè)矽塵超標崗位整改情況分析[J];中國衛(wèi)生工程學(xué);2014年05期

3 武珊珊;侯玉更;程炳忠;張露新;馬駿;;天津市東麗區(qū)矽塵作業(yè)企業(yè)粉塵職業(yè)危害現(xiàn)狀調(diào)查[J];工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病;2013年06期

4 韓羽楠;叢集美;孫華屹;;矽塵暴露誘發(fā)自身免疫病及其機制的概述[J];中國科技信息;2011年16期

5 林春芳;劉秉慈;李濤;范雪云;高艾;賈效偉;;我國矽塵防治中對矽塵表面性質(zhì)重視的必要性[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2006年05期

6 馬勇,高默杰,靳秋月,王奕飛,杜�？�,王世鑫;煙酸對染矽塵大鼠肺灌洗液細胞成份的影響[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年03期

7 李宏偉;高秀霞;杜�？�;曾錦波;王世鑫;;染矽塵大鼠早期肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β_1的表達[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年06期

8 高秀霞;杜海科;李宏偉;王奕飛;王世鑫;;川芎嗪對染矽塵大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β_1表達的影響[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年06期

9 閻躍進,陶寧,田菊鴿,吳燦澤;地質(zhì)勘探工人歷年接觸矽塵的評價[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2001年05期

10 霍洪麗,周瑋;吉鐵分局采石場矽塵作業(yè)基本情況[J];鐵道勞動安全衛(wèi)生與環(huán)保;2000年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 馬小兵;廖唐東;孫樹勛;;矽塵對人巨噬細胞MMP-9及TIMP-1表達的體外研究[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

2 張海鵬;王瑞;王輝;張瑋;;染矽塵大鼠克拉拉細胞蛋白和表面活性蛋白D表達變化的研究[A];中國職業(yè)安全健康協(xié)會2013年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

3 劉偉;陳娟娟;魏茂提;王世鑫;;染矽塵大鼠早期肺組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜差異分析[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第29屆學(xué)術(shù)年會暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會論文集[C];2009年

4 周瑤;何麗;寧華誠;胡賽;劉曉丹;關(guān)華;黃瑞雪;周平坤;;p53/lncRNA RMRP/miR-122回路激活Notch通路促進游離二氧化硅所致EMT的實驗研究[A];2019年海峽兩岸暨港澳青年科學(xué)家毒理學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2019年

5 陳尚雅;張恩國;楊葉;賈強;薄存香;張玉;杜忠君;邵華;;脂肪間充質(zhì)干細胞對染矽塵大鼠肺纖維化的作用研究[A];中國毒理學(xué)會第七次全國會員代表大會暨中國毒理學(xué)會第六次中青年學(xué)者科技論壇論文摘要[C];2018年

6 靳蘇香;吳秋云;嚴瑋文;倪春輝;;miR-489對矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化成熟期的治療作用[A];中國毒理學(xué)會第七次全國會員代表大會暨中國毒理學(xué)會第六次中青年學(xué)者科技論壇論文摘要[C];2018年

7 周瑤;何麗;寧華誠;胡賽;劉曉丹;關(guān)華;黃瑞雪;周平坤;;p53/lncRNA RMRP/miR122回路在矽塵所致EMT中的作用及機制研究[A];中國毒理學(xué)會第九次全國毒理學(xué)大會論文集[C];2019年

8 李超;殷園園;趙霏;劉芳煒;陳瑩;陳杰;;4-1BB-ASK-1信號通路對矽塵導(dǎo)致肺纖維化的影響[A];第六屆中國毒理學(xué)會免疫毒理專業(yè)委員會換屆及學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2016年

9 陳尚雅;張恩國;楊葉;賈強;薄存香;張玉;杜忠君;邵華;;脂肪間充質(zhì)干細胞對染矽塵大鼠肺纖維化的作用研究[A];2018環(huán)境與健康學(xué)術(shù)會議--精準環(huán)境健康：跨學(xué)科合作的挑戰(zhàn)論文匯編[C];2018年

10 胡瓊;;某縣石英砂企業(yè)矽塵作業(yè)人員職業(yè)健康檢查結(jié)果[A];第十三次全國勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

相關(guān)重要報紙文章 前7條

1 記者 魯偉 通訊員 龔葦萱;長期接觸矽塵導(dǎo)致工人死亡率升高[N];中國科學(xué)報;2012年

2 安文;怎樣預(yù)防矽肺病？[N];中華合作時報;2005年

3 無為;粉塵對職工有什么危害[N];中國礦業(yè)報;2000年

4 本報記者 王旭;九月 讓我們傾聽安全的聲音[N];中華合作時報;2004年

5 楊鋒 金偉 江春 楚豐;別讓粉塵偷偷進駐你的肺[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

6 周前進邋胡修德 陽琳;華中科大同濟醫(yī)學(xué)院矽肺研究通過省級鑒定[N];中國醫(yī)藥報;2007年

7 呂莉;女工，關(guān)愛你自己[N];大眾衛(wèi)生報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 杜思f

本文編號：2600731