本文關(guān)鍵詞：模擬微重力對K562細(xì)胞紅系分化及細(xì)胞骨架的影響研究

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【摘要】：研究背景航天飛行會(huì)導(dǎo)致人體血液、消化、生殖、心血管、免疫和骨骼等多個(gè)器官系統(tǒng)的功能改變。空間環(huán)境對人類機(jī)體的影響已成為科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。微重力環(huán)境與地球上1 g的重力環(huán)境不同,又稱零重量,它是空間環(huán)境的主要特點(diǎn)之一。研究航天飛行過程中微重力環(huán)境對航天員健康的影響,探討其發(fā)生機(jī)理及制定有效的防治措施已成為一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。血紅蛋白總量和紅細(xì)胞數(shù)量的減少、紅細(xì)胞體積的減小早在20世紀(jì)就引起了航天醫(yī)學(xué)家們的重視,他們把這種現(xiàn)象稱為“航天貧血癥”(spaceflight anemia)。目前科學(xué)家們尚未能解釋這一現(xiàn)象發(fā)生的原因,但有研究表明微重力可能是通過影響造血干細(xì)胞的分化和凋亡而引起貧血現(xiàn)象。紅細(xì)胞的生成是一個(gè)復(fù)雜的過程,包括造血干細(xì)胞發(fā)育為原成紅細(xì)胞再進(jìn)一步分化為成熟紅細(xì)胞,期間各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用使得這一過程達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子家族中GATA家族和Ets家族在紅系分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。GATA家族是含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族,其中GATA-1和GATA-2主要分布在肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、紅系和巨核系的細(xì)胞中。GATA-1是造血系統(tǒng)特有的轉(zhuǎn)錄因子,主要在紅系發(fā)育晚期表達(dá),為正常紅細(xì)胞發(fā)育所必需,它能激活多種紅系分化特有基因,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞向紅系分化,并且在細(xì)胞向紅系分化時(shí)表達(dá)顯著上升。GATA-1表達(dá)的增加也是K562細(xì)胞向紅系分化成熟的一個(gè)重要標(biāo)志。GATA-2則主要在多能的前體細(xì)胞中表達(dá),對未成熟的造血細(xì)胞的增殖與維持有重要意義。過表達(dá)GATA-2會(huì)抑制細(xì)胞向紅系分化,促進(jìn)其向巨核系分化。Ets家族是轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的一個(gè)家族之一,其中Ets-1在造血系統(tǒng)的調(diào)控中扮演著重要角色,它能調(diào)控淋巴細(xì)胞的生成和NK細(xì)胞的發(fā)育,在紅系分化過程中起負(fù)向調(diào)控作用。Ets-1可以通過上調(diào)GATA-2的表達(dá)從而抑制紅系分化,同時(shí)Ets-1還與GATA-2在紅系分化過程中起協(xié)同作用。綜上,任何一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常均可能導(dǎo)致造血干/祖細(xì)胞紅系分化障礙。細(xì)胞骨架是微管、中間纖維和微絲組成的纖維狀聚合物與細(xì)胞膜上黏附斑、細(xì)胞間連接等特殊結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系,與各種調(diào)控蛋白交錯(cuò)連接,并與細(xì)胞核的支架系統(tǒng)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。微管由a和p微管蛋白組成,正常時(shí)以p二聚體即β-Tubulin形式存在,具有維持細(xì)胞形態(tài)、輔助細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ?在真核細(xì)胞的染色體分離中發(fā)揮重要作用。中間纖維的化學(xué)組成比較復(fù)雜,主要由波形蛋白(Vimentin)構(gòu)成,與核基質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)核內(nèi)基因的表達(dá)影響細(xì)胞分化。微絲是一個(gè)實(shí)心狀的纖維,主要以F-actin多聚體形式存在,是遷移的主要驅(qū)動(dòng)力,在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程中起了重要的作用。細(xì)胞骨架是外力發(fā)揮作用和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)力刺激的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),細(xì)胞可以通過細(xì)胞骨架感受重力通過物理和化學(xué)信號途徑傳導(dǎo)的力學(xué)信號。細(xì)胞骨架是非常活躍的系統(tǒng),它的單體和聚合體之間可以相互轉(zhuǎn)化發(fā)生改變,正是這種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞骨架在感知微重力上發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞的骨架蛋白表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架受損可影響細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。微重力條件下細(xì)胞膜蛋白感受微重力所致的細(xì)胞骨架的變化可以激活ERK、P38和JNK等下游的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,影響核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子及jun、c-fos等基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分化的改變機(jī)制與細(xì)胞骨架的改變有關(guān)。綜上,細(xì)胞骨架中任何組分發(fā)生異常導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞均可能影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。因此,本實(shí)驗(yàn)即通過檢測K562細(xì)胞的分化、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及細(xì)胞骨架的表達(dá)情況研究模擬微重力對K562細(xì)胞分化的影響及可能機(jī)制。研究者目前通過航天空間站和地面模型兩種方式獲得微重力來進(jìn)行相關(guān)的生命科學(xué)研究。由于空間研究機(jī)會(huì)少、實(shí)驗(yàn)周期長、費(fèi)用昂貴不能廣泛的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。地面微重力研究主要應(yīng)用小鼠尾吊模型及微重力效應(yīng)模擬裝置進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary cell culture system,RCCS)是目前公認(rèn)的地面微重力效應(yīng)模擬培養(yǎng)裝置,其所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果和真實(shí)微重力下實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很好的相關(guān)性,可以用來行微重力相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。本實(shí)驗(yàn)使用第四代RCCS(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境,觀察該環(huán)境下K562細(xì)胞紅系分化的情況并探索其可能機(jī)制。K562細(xì)胞株是具有向終末紅系、巨核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系等多向分化潛能的人紅白血病細(xì)胞。由于造血干細(xì)胞獲取困難、培養(yǎng)周期較長,K562細(xì)胞株已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于紅系分化研究模型中。氯化高鐵血紅素(Hemin)是常見的紅系分化誘導(dǎo)劑,可以誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞和K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的合成。研究目的本實(shí)驗(yàn)旨在研究模擬微重力對K562細(xì)胞紅系分化的影響以進(jìn)一步探究“航天貧血癥”發(fā)生的可能機(jī)制。研究方法本實(shí)驗(yàn)采用第四代旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境,采用人紅白血病來源的K562細(xì)胞株作為造血干／祖細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為兩部分,第一部分實(shí)驗(yàn)采用Hemin作為K562細(xì)胞紅系分化的誘導(dǎo)劑,將實(shí)驗(yàn)分為正常重力(normal gravity)培養(yǎng)組(NG組),Hemin誘導(dǎo)組(Hemin組),模擬微重力(simulated microgravity)培養(yǎng)組(SMG組)和模擬微重力下Hemin誘導(dǎo)組(Hemin+SMG組).培養(yǎng)K562細(xì)胞48h后采用聯(lián)苯胺染色法觀察四種培養(yǎng)條件下K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的表達(dá)情況；分別培養(yǎng)K562細(xì)胞6h、12h、24h、48h 后采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Reverse Transcriptase-quantitative PCR,RT-qPCR)法檢測四種培養(yǎng)條件下紅系分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、GATA-2和Ets-1的nRNA表達(dá)水平。第二部分實(shí)驗(yàn)分為NG組和SMG組,培養(yǎng)K562細(xì)胞24h后采用間接免疫熒光法觀察兩種培養(yǎng)條件下K562細(xì)胞骨架蛋白F-actin.p-Tubulin和Vimentin的熒光強(qiáng)度；采用RT-qPCR法檢測6h.12h.24h.48h細(xì)胞骨架F-actin.p-Tubulin和Vimentin的nRNA表達(dá)水平；、Vestern blot法檢測12h、24h細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。本研究不同時(shí)間點(diǎn)之間無相關(guān)性,為獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件,計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用兩樣本t檢驗(yàn)及ANOVA法分析比較,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果(1) Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率明顯高于NG組,SMG+Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率顯著低于Hemin組。(2) Hemin處理K562細(xì)胞后,GATA-1基因表達(dá)水平在12h后升高,GATA-2基因表達(dá)水平在12h后降低,Ets-1基因表達(dá)水平在6h即出現(xiàn)明顯降低；模擬微重力處理K562細(xì)胞后,GATA-1基因表達(dá)水平在24h后明顯降低,GATA-2基因表達(dá)水平在12h后升高,Ets-1基因表達(dá)水平在24h后出現(xiàn)明顯升高；模擬微重力和H emin共同處理的K562細(xì)胞與單純Hemin誘導(dǎo)細(xì)胞比較,GATA-1基因表達(dá)水平在24h后降低,GATA-2基因表達(dá)水平無明顯改變,Ets-1基因表達(dá)水平在24h后出現(xiàn)升高。(3)模擬微重力處理K562細(xì)胞后,F-actin、β-Tubulin和Vimentin的熒光強(qiáng)度較NG組均明顯減弱。(4)SMG組細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的基因表達(dá)水平在12h和24h均較NG組減少,6h和48h無明顯改變。(5)SMG組細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平在12h和24h均較NG組減少。結(jié)論模擬微重力可以抑制K562細(xì)胞紅系分化。其機(jī)制可能為模擬微重力使對重力敏感的細(xì)胞骨架表達(dá)發(fā)生下調(diào),微絲、微管解聚,中間纖維斷裂,細(xì)胞骨架破壞,影響轉(zhuǎn)錄因子G ATA-1、GATA-2、Ets-1的基因表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力 航天性貧血 K562細(xì)胞 細(xì)胞骨架 分化 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R852.22
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-15
• 前言15-20
• 1. 微重力與模擬微重力15-16
• 2. 紅系分化與調(diào)控16-17
• 3. 細(xì)胞骨架17-18
• 4. 微重力對細(xì)胞影響的研究現(xiàn)狀18-20
• 第一部分 模擬微重力對K562細(xì)胞紅系分化的影響20-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-33
• 1.4 討論33-35
• 第二部分 模擬微重力對K562細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響35-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料36-39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法39-46
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-53
• 2.4 討論53-56
• 全文總結(jié)56-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 攻讀學(xué)位期間成果66-67
• 致謝67-69

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 吳彬;鄭磊;胡秀梅;高雅;岳春燕;洪佳瓊;宋潔;平寶紅;;模擬微重力抑制K562細(xì)胞的紅系分化[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年10期

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本文編號：624690