發(fā)布時間：2017-06-09 21:32

  本文關(guān)鍵詞：重組多肽CS5931的制備工藝優(yōu)化及體內(nèi)外抗結(jié)腸癌作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:對重組多肽CS5931的制備工藝進行優(yōu)化,并研究其體內(nèi)外抗結(jié)腸癌的作用,為將來的中試放大和藥理學(xué)研究提供依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。方法:1.以p ET28a為載體質(zhì)粒,以大腸桿菌BL21(DE3)為表達菌株,構(gòu)建質(zhì)粒p ET28a-CS5931和p ET28a-DDDK-CS5931并分別轉(zhuǎn)化到表達菌株中,進行重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達;將發(fā)酵所得菌體裂解后進行超聲破碎離心處理,利用鎳柱親和層析法、使用儀器AKTA-Purifier 100進行多肽的分離純化;利用SDS-PAGE和Western blot法檢測重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達。2.以大腸桿菌BL21(DE3)/p ET28a-CS5931為發(fā)酵菌株,從碳源、氮源、磷酸鹽、Mg2+、誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等方面優(yōu)化表達體系的發(fā)酵制備工藝。利用Plackett-Burman實驗篩選出對重組多肽CS5931的表達影響最大的3個因素,并結(jié)合單因素實驗結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面實驗,通過中心組和實驗(CCD)結(jié)果篩選出3個因素的最佳組合。3.利用單因素實驗優(yōu)化復(fù)性液成分,包括小分子物質(zhì)甘油、尿素和谷胱甘肽,并檢測了利用優(yōu)化后的復(fù)性液進行復(fù)性所制備重組多肽CS5931的表達量及抗結(jié)腸癌細胞HCT116增殖的活性。4.利用MTT法評價重組薩氏海鞘多肽CS5931和CS5931-EK對體外結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖抑制作用。建立人結(jié)腸癌細胞HCT116裸鼠移植瘤模型,并利用該模型考察重組薩氏海鞘多肽CS5931的體內(nèi)抗結(jié)腸癌作用。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了p ET28a/CS5931質(zhì)粒和p ET28a-DDDK-CS5931質(zhì)粒并表達了重組多肽CS5931和CS5931-EK。重組多肽CS5931經(jīng)分離純化后呈單一條帶,且純度可達到98%。重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達量分別為每升發(fā)酵液2.0 mg和1.5 mg。2.發(fā)酵制備工藝優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為酵母提取物濃度30 g/L,甘油濃度0.45%,IPTG濃度0.75 m M,誘導(dǎo)溫度16℃,誘導(dǎo)時間20 h。優(yōu)化后重組多肽CS5931的表達量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,與優(yōu)化前相比提高了2.75倍。3.優(yōu)化后的復(fù)性液能夠顯著提高重組多肽CS5931的抗結(jié)腸癌細胞HCT116增殖的活性,對人結(jié)腸癌細胞HCT116的半數(shù)抑制濃度IC50值從23.2μM下降到11.6μM(活性增強1倍)。優(yōu)化后復(fù)性液組分確定為50 m M Tris,0.5 m M EDTA,50 m M Na Cl,0.5 m M L-精氨酸,5%甘油,2 M尿素和2 m M/0.2 m M GSH/GSSH。4.所制備的重組多肽CS5931和CS5931-EK都具有顯著的體外抗結(jié)腸癌細胞增殖的活性,His-tag的有無對重組多肽的抗結(jié)腸癌作用沒有明顯影響。體內(nèi)實驗表明重組多肽CS5931在25 mg/kg劑量時顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116裸鼠移植瘤的生長,且抗癌效果呈劑量依賴性,在同劑量(50 mg/kg)下抗癌效果優(yōu)于陽性對照藥環(huán)磷酰胺(CTX),同時用藥期間未發(fā)現(xiàn)動物死亡,顯示該重組多肽具有一定的安全性。結(jié)論:1.通過單因素實驗,Plackett-Burman實驗和中心組和實驗對重組多肽CS5931的制備工藝進行了優(yōu)化。使用優(yōu)化后的工藝制備重組多肽CS5931,表達量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,與優(yōu)化前相比提高了2.75倍。復(fù)性液優(yōu)化后可顯著提高重組多肽CS5931的體外抗結(jié)腸癌細胞增殖活性,且His-tag的有無對重組多肽CS5931的抗結(jié)腸癌作用沒有明顯影響。2.所制備的重組多肽CS5931具有較好的體外和體內(nèi)抗結(jié)腸癌作用,體外可顯著抑制人結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖;體內(nèi)可顯著抑制HCT116裸鼠移植瘤的生長,提示在結(jié)腸癌的治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：重組多肽CS5931 薩氏海鞘 抗腫瘤 工藝優(yōu)化 復(fù)性 結(jié)腸癌
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、重組多肽CS5931的原核表達及純化16-28
• 1.1 對象和方法16-24
• 1.1.1 實驗菌株16
• 1.1.2 實驗試劑16-17
• 1.1.3 實驗儀器17
• 1.1.4 實驗方法17-24
• 1.2 結(jié)果24-26
• 1.2.1 重組多肽CS5931的純化24
• 1.2.2 重組多肽CS5931的誘導(dǎo)表達結(jié)果及驗證24-26
• 1.3 討論26-27
• 1.4 小結(jié)27-28
• 二、重組多肽CS5931的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化28-45
• 2.1 對象和方法28-30
• 2.1.1 實驗菌株28
• 2.1.2 實驗試劑28
• 2.1.3 實驗儀器28
• 2.1.4 實驗方法28-30
• 2.2 結(jié)果30-43
• 2.2.1 單因素實驗篩選結(jié)果30-37
• 2.2.2 Plackett Burman實驗結(jié)果37-38
• 2.2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析38-42
• 2.2.4 響應(yīng)面結(jié)果預(yù)測評價42
• 2.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化42-43
• 2.3 討論43-44
• 2.4 小結(jié)44-45
• 三、重組多肽CS5931復(fù)性條件的優(yōu)化及體外抗腫瘤活性評價45-54
• 3.1 對象和方法45-49
• 3.1.1 實驗菌株45
• 3.1.2 實驗試劑45
• 3.1.3 實驗儀器45-46
• 3.1.4 實驗方法46-49
• 3.2 結(jié)果49-52
• 3.2.1 人結(jié)腸癌細胞HCT116的生長特點49
• 3.2.2 不同復(fù)性條件對重組多肽CS5931抗人結(jié)腸癌活性的影響49-51
• 3.2.3 復(fù)性條件的驗證51-52
• 3.2.4 MTT法檢測重組多肽CS5931和重組多肽CS5931-EK的活性52
• 3.3 討論52-53
• 3.4 小結(jié)53-54
• 四、重組多肽CS5931的體內(nèi)抗腫瘤活性評價54-57
• 4.1 對象和方法54
• 4.1.1 實驗對象54
• 4.1.2 實驗試劑54
• 4.1.3 實驗儀器54
• 4.1.4 實驗方法54
• 4.2 結(jié)果54-56
• 4.2.1 重組多肽CS5931對人結(jié)腸癌HCT116裸鼠移植瘤的生長抑制作用結(jié)果54-56
• 4.3 討論56
• 4.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-61
• 綜述 多肽類抗腫瘤藥物的研究進展61-76
• 綜述參考文獻69-76
• 致謝76-77
• 個人簡歷77

  本文關(guān)鍵詞：重組多肽CS5931的制備工藝優(yōu)化及體內(nèi)外抗結(jié)腸癌作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：436706