發(fā)布時(shí)間：2017-06-09 18:11

  本文關(guān)鍵詞：重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分重組人p66Shc腺病毒對(duì)HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用目的：p66Shc是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)活性氧水平、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及與壽命相關(guān)的多功能基因。近年來(lái),其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用也引起了研究者的注意,但是關(guān)于p66Shc對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用結(jié)果仍有爭(zhēng)議。為了深入研究p66Shc蛋白對(duì)腫瘤的生物效應(yīng),我們將前期構(gòu)建的重組人p66Shc腺病毒(AdenoX-p66Shc)表達(dá)載體分別感染HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞,觀察p66Shc高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。方法：MTT檢測(cè)AdenoX-p66Shc對(duì)HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞活力的影響,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為正常對(duì)照組細(xì)胞；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)ROS水平；ELISA檢測(cè)細(xì)胞8-OHdG的含量；Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布；Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：1.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的增殖活性均受到明顯抑制。但是HUVECs細(xì)胞的增殖并未受到抑制。2. HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的活性氧水平顯著升高,伴隨著DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG含量的增加。3.各組HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)正常,染色質(zhì)均勻；細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的凋亡率均無(wú)明顯變化。4.流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的G2/M期比例顯著升高,G1期比例顯著下降。5.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的p66Shc表達(dá)水平均有明顯升高,同時(shí)p53蛋白表達(dá)水平和p-p53水平也有顯著升高。凋亡相關(guān)蛋白Bax、 Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平均無(wú)顯著變化；而G2/M期相關(guān)蛋白CyclinB1和CDK1表達(dá)水平則明顯升高。結(jié)論：感染AdenoX-p66Shc可以抑制HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖,但對(duì)正常細(xì)胞沒有抑制作用。AdenoX-p66Shc感染引起的p66Shc蛋白表達(dá)水平升高可導(dǎo)致活性氧水平增高,引起DNA損傷,誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。第二部分賴氨藤黃酸鹽體外抗腫瘤活性及機(jī)制研究目的：藤黃酸是藤黃的主要活性成分,已有的研究表明,藤黃酸具有明顯的抗腫瘤作用。藤黃酸在醇類、酮類等有機(jī)溶劑中溶解度較大,但是在水中溶解度很小,很大程度限制了其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。本研究中,我們采用本室自制的水溶性的賴氨藤黃酸鹽(GAL),研究GAL的抗腫瘤活性,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討。方法：采用質(zhì)譜分析檢測(cè)GAL信號(hào)峰；MTT方法檢測(cè)GAL對(duì)MCF-7細(xì)胞存活力率的影響；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化；Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：1.質(zhì)譜分析結(jié)果在荷質(zhì)比(m/z)為775.4處有一特征強(qiáng)信號(hào)峰。藤黃酸和賴氨酸經(jīng)離子鍵結(jié)合形成的GAL的相對(duì)分子量理論值為775,說(shuō)明該信號(hào)峰為GAL的信號(hào)峰。2.GAL對(duì)MCF-7細(xì)胞的存活率有抑制作用,并且隨著GAL濃度的增大,處理時(shí)間的延長(zhǎng),MCF-7細(xì)胞的存活率不斷下降。GAL對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用與GA相當(dāng)。同時(shí)加入NAC后,MCF-7細(xì)胞活力有所逆轉(zhuǎn),NAC能夠阻斷GAL對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用。3.GAL處理MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平隨GAL濃度的增加而升高,加入NAC后可以使升高的活性氧水平有所降低。4.MCF-7細(xì)胞經(jīng)GAL處理24 h后,大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,如染色質(zhì)凝聚,細(xì)胞皺縮以及凋亡小體的形成。Annexin V/PI-FITC雙染結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GAL引起MCF-7細(xì)胞凋亡,并且凋亡率隨GAL濃度升高而增加。5. Western Blot結(jié)果顯示GAL降低SIRT1的表達(dá),同時(shí)升高FOXO-3a的磷酸化水平和p27Kip1的表達(dá)水平。此外GAL還可促進(jìn)Cleaved-Caspase-3的表達(dá)。結(jié)論：GAL具有與GA同樣的抑制MCF-7細(xì)胞增殖效果。GAL升高M(jìn)CF-7細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平,并且通過SIRT1/FOXO3a/p27Kip1信號(hào)通路和Caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：p66Shc 活性氧 HeLa MCF-7 增殖 賴氨藤黃酸鹽 SIRT1 活性氧 MCF-7 N-乙酰半胱氨酸
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一章 前言11-19
• 1. p66Shc的結(jié)構(gòu)及功能11-12
• 2.p66Shc的分布及定位12
• 3.p66Shc與氧化應(yīng)激12-14
• 4.p66Shc與細(xì)胞凋亡14-15
• 5.p66Shc與p53的相互作用15-16
• 參考文獻(xiàn)16-19
• 第二章 重組人p66Shc腺病毒對(duì)HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用19-53
• 前言19-20
• 材料與方法20-32
• 結(jié)果32-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 第三章 賴氨藤黃酸鹽體外抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究53-71
• 前言53-54
• 材料與方法54-55
• 結(jié)果55-64
• 討論64-66
• 結(jié)論66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 第四章 全文總結(jié)71-72
• 文章發(fā)表情況72
• 個(gè)人簡(jiǎn)介72-73
• 致謝73

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 季宇彬;高鵬;鄒翔;;G_2/M檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控機(jī)制研究概述[A];2008年中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第八屆中國(guó)藥師周論文集[C];2008年

  本文關(guān)鍵詞：重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：436267