本文關(guān)鍵詞：重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對腫瘤細胞的抑制作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分重組人p66Shc腺病毒對HeLa細胞和MCF-7細胞增殖的抑制作用目的：p66Shc是調(diào)節(jié)哺乳動物體內(nèi)活性氧水平、誘導細胞凋亡以及與壽命相關(guān)的多功能基因。近年來,其對腫瘤細胞的作用也引起了研究者的注意,但是關(guān)于p66Shc對腫瘤細胞的作用結(jié)果仍有爭議。為了深入研究p66Shc蛋白對腫瘤的生物效應,我們將前期構(gòu)建的重組人p66Shc腺病毒(AdenoX-p66Shc)表達載體分別感染HeLa細胞和MCF-7細胞,觀察p66Shc高表達對細胞增殖的作用及機制。方法：MTT檢測AdenoX-p66Shc對HeLa細胞和MCF-7細胞活力的影響,人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)作為正常對照組細胞；DCFH-DA熒光探針檢測ROS水平；ELISA檢測細胞8-OHdG的含量；Hoechst 33342染色觀察細胞核形態(tài)變化；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率和細胞周期分布；Western blot檢測細胞相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果：1.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa細胞和MCF-7細胞的增殖活性均受到明顯抑制。但是HUVECs細胞的增殖并未受到抑制。2. HeLa細胞和MCF-7細胞的活性氧水平顯著升高,伴隨著DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG含量的增加。3.各組HeLa細胞的細胞核形態(tài)正常,染色質(zhì)均勻；細胞凋亡率的結(jié)果顯示,HeLa細胞和MCF-7細胞的凋亡率均無明顯變化。4.流式細胞周期檢測結(jié)果顯示,HeLa細胞和MCF-7細胞的G2/M期比例顯著升高,G1期比例顯著下降。5.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa細胞和MCF-7細胞的p66Shc表達水平均有明顯升高,同時p53蛋白表達水平和p-p53水平也有顯著升高。凋亡相關(guān)蛋白Bax、 Bcl-2、Caspase-3的表達水平均無顯著變化；而G2/M期相關(guān)蛋白CyclinB1和CDK1表達水平則明顯升高。結(jié)論：感染AdenoX-p66Shc可以抑制HeLa細胞和MCF-7細胞增殖,但對正常細胞沒有抑制作用。AdenoX-p66Shc感染引起的p66Shc蛋白表達水平升高可導致活性氧水平增高,引起DNA損傷,誘導p53蛋白表達,使細胞發(fā)生G2/M期阻滯,從而抑制腫瘤細胞的增殖。第二部分賴氨藤黃酸鹽體外抗腫瘤活性及機制研究目的：藤黃酸是藤黃的主要活性成分,已有的研究表明,藤黃酸具有明顯的抗腫瘤作用。藤黃酸在醇類、酮類等有機溶劑中溶解度較大,但是在水中溶解度很小,很大程度限制了其在腫瘤治療方面的應用。本研究中,我們采用本室自制的水溶性的賴氨藤黃酸鹽(GAL),研究GAL的抗腫瘤活性,并對其機制進行了探討。方法：采用質(zhì)譜分析檢測GAL信號峰；MTT方法檢測GAL對MCF-7細胞存活力率的影響；DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧水平的變化；Hoechst 33342染色觀察細胞核形態(tài)變化；流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率；Western Blot法檢測相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：1.質(zhì)譜分析結(jié)果在荷質(zhì)比(m/z)為775.4處有一特征強信號峰。藤黃酸和賴氨酸經(jīng)離子鍵結(jié)合形成的GAL的相對分子量理論值為775,說明該信號峰為GAL的信號峰。2.GAL對MCF-7細胞的存活率有抑制作用,并且隨著GAL濃度的增大,處理時間的延長,MCF-7細胞的存活率不斷下降。GAL對MCF-7細胞的抑制作用與GA相當。同時加入NAC后,MCF-7細胞活力有所逆轉(zhuǎn),NAC能夠阻斷GAL對MCF-7細胞的抑制作用。3.GAL處理MCF-7細胞后,細胞內(nèi)的活性氧水平隨GAL濃度的增加而升高,加入NAC后可以使升高的活性氧水平有所降低。4.MCF-7細胞經(jīng)GAL處理24 h后,大多數(shù)細胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學改變,如染色質(zhì)凝聚,細胞皺縮以及凋亡小體的形成。Annexin V/PI-FITC雙染結(jié)果進一步證實GAL引起MCF-7細胞凋亡,并且凋亡率隨GAL濃度升高而增加。5. Western Blot結(jié)果顯示GAL降低SIRT1的表達,同時升高FOXO-3a的磷酸化水平和p27Kip1的表達水平。此外GAL還可促進Cleaved-Caspase-3的表達。結(jié)論：GAL具有與GA同樣的抑制MCF-7細胞增殖效果。GAL升高MCF-7細胞內(nèi)的活性氧水平,并且通過SIRT1/FOXO3a/p27Kip1信號通路和Caspase-3信號通路誘導細胞發(fā)生凋亡,從而抑制MCF-7細胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：p66Shc 活性氧 HeLa MCF-7 增殖 賴氨藤黃酸鹽 SIRT1 活性氧 MCF-7 N-乙酰半胱氨酸
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一章 前言11-19
• 1. p66Shc的結(jié)構(gòu)及功能11-12
• 2.p66Shc的分布及定位12
• 3.p66Shc與氧化應激12-14
• 4.p66Shc與細胞凋亡14-15
• 5.p66Shc與p53的相互作用15-16
• 參考文獻16-19
• 第二章 重組人p66Shc腺病毒對HeLa細胞和MCF-7細胞增殖的抑制作用19-53
• 前言19-20
• 材料與方法20-32
• 結(jié)果32-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48
• 參考文獻48-53
• 第三章 賴氨藤黃酸鹽體外抗腫瘤活性及分子機制研究53-71
• 前言53-54
• 材料與方法54-55
• 結(jié)果55-64
• 討論64-66
• 結(jié)論66
• 參考文獻66-71
• 第四章 全文總結(jié)71-72
• 文章發(fā)表情況72
• 個人簡介72-73
• 致謝73

【引證文獻】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 季宇彬;高鵬;鄒翔;;G_2/M檢驗點調(diào)控機制研究概述[A];2008年中國藥學會學術(shù)年會暨第八屆中國藥師周論文集[C];2008年

  本文關(guān)鍵詞：重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對腫瘤細胞的抑制作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：436267