本文關(guān)鍵詞：抗新生血管生成肽ES-2的殼寡糖化修飾及其抗新生血管生成活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)是從一種從小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤上清中分離純化獲得的內(nèi)源性新生血管生成抑制劑,可通過抑制腫瘤組織新生血管的生成,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤營養(yǎng)供給途徑和廢物代謝途徑的切斷,從而起到抗腫瘤的作用。ES結(jié)構(gòu)中有一短肽段(IVRRADRAAVP,ES-2)同樣具有明顯的抗新生血管生成活性,且更容易通過固相合成的方式獲得。但ES-2也存在體內(nèi)半衰期較短和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),其應(yīng)用受到了很大的限制。研究表明,通過化學(xué)修飾的手段有望改善其這些缺點(diǎn)。殼寡糖具有一定的抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移活性、具一定靶向性且結(jié)構(gòu)明確,季銨化后的殼寡糖水溶性及帶正電荷的能力更佳。故本課題采用6-O-季銨化殼寡糖(6-O-2′-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan oligosaccharide,O-HTCCOS)對(duì)ES-2的末端羧基進(jìn)行了化學(xué)修飾,獲得了6-O-季銨化殼寡糖-ES-2修飾物(O-HTCCOS-ES-2),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),該結(jié)合物既保留了較高的抗新生血管生成活性,又整合了殼寡糖的良好特性,使其具有穩(wěn)定性高、靶向性強(qiáng)和細(xì)胞親和性強(qiáng)等特性。本課題研究內(nèi)容和取得的主要成果如下:1.6-O-季銨化殼寡糖(O-HTCCOS)的合成與表征經(jīng)過三步化學(xué)反應(yīng)在殼寡糖C6位的羥基上引入季銨鹽側(cè)鏈,后經(jīng)透析并冷凍干燥得到水溶性更好的季銨化殼寡糖,產(chǎn)率為95.26%。通過IR和1H NMR分析表征,O-HTCCOS結(jié)構(gòu)與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。茚三酮比色法測定6-O-季銨化殼寡糖的自由氨基率為87.35%。2.6-O季銨化殼寡糖-ES-2肽修飾物(O-HTCCOS-ES-2)的合成與表征以EDC/NHS作為交聯(lián)劑,通過兩步反應(yīng)由ES-2肽分子上的羧基與O-HTCCOS分子的氨基通過酰胺鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)ES-2的末端羧基的結(jié)構(gòu)修飾,修飾率超過50%。采用SephadexG-25凝膠層析柱進(jìn)行分離純化,最終獲得了O-HTCCOS-ES-2純品。通過MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定表明ES-2通過-CO-NH-被O-HTCCOS修飾,且ES-2與O-HTCCOS連接比例為1:1,即一分子ES-2被一分子O-HTCCOS修飾。3.O-HTCCOS-ES-2的熱穩(wěn)定性研究分別研究了O-HTCCOS-ES-2、ES-2在25℃和37℃環(huán)境中放置相同時(shí)間后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抑制能力的變化情況,從而比較二者的穩(wěn)定性,結(jié)果表明,O-HTCCOS-ES-2的熱穩(wěn)定性優(yōu)于ES-2。4.O-HTCCOS-ES-2的細(xì)胞親和性研究流式細(xì)胞術(shù)研究結(jié)果表明,與ES-2相比,O-HTCCOS-ES-2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的親和性更強(qiáng),更加易于進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。5.O-HTCCOS-ES-2的體內(nèi)外生物活性研究5.1 O-HTCCOS-ES-2的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用研究(1)CCK-8法檢測抗細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及兩者混合物在作用48 h后,均可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,其中O-HTCCOS-ES-2作用效果明顯優(yōu)于ES-2或O-HTCCOS與ES-2混合物。且該抑制作用呈現(xiàn)出一定的藥物濃度依賴性。(2)管腔形成實(shí)驗(yàn)測定體外抗新生血管生成活性結(jié)果表明,不同濃度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2混合物分別作用6 h后,O-HTCCOS-ES-2修飾物的抗新生血管生成作用效果明顯比ES-2以及兩者混合物要強(qiáng)很多,且抗新生血管作用效果具有藥物濃度依賴性。5.2 O-HTCCOS-ES-2的體內(nèi)抗新生血管生成活性研究(1)雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2的混合物三種藥物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成均有一定的抑制作用,血管數(shù)量和其分支都有一定的減少,但O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用效果優(yōu)于ES-2以及混合物,且體內(nèi)抗新生血管生成作用效果隨著藥物濃度的增大而加強(qiáng)。(2)斑馬魚模型體節(jié)血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,O-HTCCOS-ES-2,ES-2以及兩者混合物均可抑制斑馬魚體節(jié)間新生血管的生成,且其中O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用為最佳。5.3 O-HTCCOS-ES-2的抗細(xì)胞遷移作用研究劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法測定抗細(xì)胞遷移的抑制作用的兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及兩者混合物均可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,其中O-HTCCOS-ES-2表現(xiàn)出了最佳活性,且抑制遷移的作用呈現(xiàn)出藥物濃度依賴性。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮抑素 ES-2 6-O季銨化殼寡糖 新生血管抑制作用
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96;R943
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 符號(hào)說明8-11
• 第1章 前言11-15
• 1.1 內(nèi)皮抑素概述11-12
• 1.1.1 ES的來源和結(jié)構(gòu)11
• 1.1.2 ES的生物活性11
• 1.1.3 ES的抗新生血管生成和抗腫瘤機(jī)制11-12
• 1.2 ES-2 肽概述12-13
• 1.2.1 ES-2 的生物活性12-13
• 1.2.2 ES-2 的作用機(jī)制13
• 1.3 多糖對(duì)多肽的化學(xué)修飾13-14
• 1.3.1 多肽的化學(xué)修飾13
• 1.3.2 殼寡糖作為修飾劑的優(yōu)勢13-14
• 1.4 本課題研究內(nèi)容及擬解決的問題14-15
• 第2章 6-O季銨化殼寡糖-ES-2 修飾物（O-HTCCOS-ES-2）的合成與表征15-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法16-19
• 2.3.1 O-HTCCOS的合成16-17
• 2.3.2 O-HTCCOS紅外光譜（IR）一維核磁共振氫譜（1H NMR ）分析17
• 2.3.3 茚三酮比色法測定O-HTCCOS的自由氨基含量17
• 2.3.4 O-HTCCOS-ES-2 的合成17-18
• 2.3.5 O-HTCCOS-ES-2 的分離純化18
• 2.3.6 O-HTCCOS-ES-2 的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定18-19
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-22
• 2.4.1 O-HTCCOS的合成及IR和 1H NMR譜分析19-20
• 2.4.2 O-HTCCOS自由氨基率測定20-21
• 2.4.3 O-HTCCOS-ES-2 的分離純化21-22
• 2.4.4 O-HTCCOS-ES-2 的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析22
• 2.5 討論22-23
• 2.5.1 O-HTCCOS的合成與表征22
• 2.5.2 O-HTCCOS-ES-2 的合成與表征22-23
• 2.6 本章小結(jié)23-24
• 第3章 O-HTCCOS-ES-2 熱穩(wěn)定性和細(xì)胞親和性研究24-29
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備24
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 3.3.1 O-HTCCOS-ES-2 熱穩(wěn)定性研究24-25
• 3.3.2 細(xì)胞親和性研究25
• 3.4 結(jié)果25-27
• 3.4.1 修飾前后的ES-2 熱穩(wěn)定性變化25-26
• 3.4.2 修飾前后的ES-細(xì)胞親和性變化26-27
• 3.5 討論27-28
• 3.5.1 O-HTCCOS-ES-2 熱穩(wěn)定性研究27-28
• 3.5.2 O-HTCCOS-ES-2 細(xì)胞親和性研究28
• 3.6 本章小結(jié)28-29
• 第4章 O-HTCCOS-ES-2 的生物活性研究29-43
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料試劑29
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備29
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 4.3.1 O-HTCCOS-ES-2 的體外抗新生血管生成活性研究29-30
• 4.3.2 O-HTCCOS-ES-2 的體內(nèi)抗新生血管生成活性研究30-31
• 4.3.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗細(xì)胞遷移作用研究31-32
• 4.4 結(jié)果32-41
• 4.4.1 O-HTCCOS-ES-2 的體外生物活性研究32-35
• 4.4.2 O-HTCCOS-ES-2 的體內(nèi)生物活性研究35-38
• 4.4.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗細(xì)胞遷移作用研究38-41
• 4.5 討論41-42
• 4.5.1 O-HTCCOS-ES-2 的體外生物活性研究41
• 4.5.2 O-HTCCOS-ES-2 的體內(nèi)生物活性研究41-42
• 4.5.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗細(xì)胞遷移作用研究42
• 4.6 本章小結(jié)42-43
• 第5章 總結(jié)與展望43-46
• 5.1 總結(jié)43-44
• 5.2 展望44-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果50-51
• 致謝51

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  本文關(guān)鍵詞：抗新生血管生成肽ES-2的殼寡糖化修飾及其抗新生血管生成活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：434550