本文關(guān)鍵詞：磷脂爬行酶1抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是我國最重大的傳染病之一,HBV感染不僅可以引起急、慢性肝炎,還可導(dǎo)致肝炎、肝硬化和肝癌,在我國約有1.2億HBV攜帶者,其中2000多萬人為慢性乙肝患者。HBV感染和相關(guān)疾病嚴(yán)重影響患者的健康,同時也給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。現(xiàn)在對HBV感染致病機(jī)理仍不是很清楚,也沒有對HBV感染特別有效的藥物。目前臨床上廣泛使用的抗HBV藥物包括干擾素(interferon,IFN)和核苷類似物,但使用干擾素副作用較大,而核苷類似物停藥后容易復(fù)發(fā),且易發(fā)生耐藥。繼續(xù)研制和開發(fā)高效低毒的抗乙型肝炎病毒藥物仍然是當(dāng)務(wù)之急。磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase1,PLSCRl)屬于鈣離子結(jié)合的、棕櫚�；腎I型膜蛋白。研究顯示,非棕櫚酰化的PLSCR1也能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與基因組DNA結(jié)合。同時PLSCR1也是干擾素刺激基因,干擾素可以通過蛋白激酶C依次激活JNK和STAT1信號通路,繼而調(diào)控PLSCR1的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報道,通過PLSCR1特異性小干擾抑制PLSCRl表達(dá)后,IFN抑制水泡性口炎病毒和腦心肌炎病毒的活性明顯下降,所以上調(diào)PLSCRl表達(dá)有可能通過增加抗病毒基因的表達(dá)來增強IFN的抗病毒活性。我們前期通過免疫共沉淀等實驗發(fā)現(xiàn),PLSCR1與HBV表面蛋白PreS1結(jié)構(gòu)域有相互作用,進(jìn)一步研究表明在體內(nèi)外高表達(dá)PLSCR1均可以顯著抑制HBV復(fù)制,但是其作用機(jī)制尚不明確,基于這些研究結(jié)果,本課題繼續(xù)研究PLSCR1與HBV復(fù)制的關(guān)系,為進(jìn)一步研究HBV與宿主相互作用奠定基礎(chǔ),為臨床HBV治療提供新的思路。目的:探討人磷脂爬行酶1抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制。方法:將PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,提取細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中HBV-DNA,通過熒光定量PCR檢測PLSCR1與HBV1.3質(zhì)粒不同比例轉(zhuǎn)染后對HBV復(fù)制的抑制情況;設(shè)計合成PLSCR1特異性siRNA,通過半定量PCR和Western blot等方法驗證siRNA對PLSCR1在mRNA水平和蛋白水平的抑制作用;將經(jīng)過干擾素處理的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV1.3質(zhì)粒和PLSCR1特異性siRNA,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后通過半定量PCR檢測細(xì)胞中PLSCR1 mRNA表達(dá)水平變化,通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中HbsAg、HbeAg表達(dá)量的變化;在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染PLSCR1質(zhì)粒、PLSCR1 siRNA、HBV1.3質(zhì)粒48h后采用CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖變化情況,通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期變化情況;將帶有熒光素酶報告基因和HBV啟動子基因的質(zhì)粒與PLSCR1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞,48h后收取細(xì)胞上清,檢測Gluc的活性,研究PLSCR1對HBV啟動子的影響;將HepG2細(xì)胞分為空白對照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組,各組轉(zhuǎn)染對應(yīng)的質(zhì)粒,48h提取細(xì)胞總RNA,通過半定量PCR檢測與HBV感染相關(guān)的多個基因的mRNA表達(dá)水平的變化;將HepG2細(xì)胞分為空白對照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組,各組轉(zhuǎn)染對應(yīng)的質(zhì)粒,48h提取細(xì)胞總蛋白,通過Western blot檢測Toll樣受體及其信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果:在HepG2內(nèi)高表達(dá)PLSCR1可以抑制HBV的復(fù)制;經(jīng)過IFN處理的HBV陽性細(xì)胞,采用PLSCR1的siRNA抑制PLSCR1的表達(dá),降低了IFN抑制HBV的作用,而且對細(xì)胞功能無顯著影響;通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的含有HBV啟動子基因的螢光素酶報告基因表達(dá)載體與PLSCR1共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞結(jié)果顯示PLSCR1可以抑制HBV啟動子的表達(dá),HepG2細(xì)胞中,PLSCR1可以逆轉(zhuǎn)多個HBV復(fù)制引起的細(xì)胞因子的變化;HBV1.3轉(zhuǎn)染HpeG2細(xì)胞后抑制了TLR9蛋白的表達(dá),PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染后TLR9蛋白表達(dá)量恢復(fù)正常。結(jié)論:PLSCR1在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)可以抑制HBV復(fù)制;IFN通過PLSCR1發(fā)揮抗HBV作用;抑制或過表達(dá)PLSCR1對細(xì)胞功能沒有明顯影響;PLSCR1蛋白在HepG2細(xì)胞中定主要分布于細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中;PLSCR1通過抑制HBV啟動子的表達(dá)而抑制HBV的復(fù)制;PLSCR1通過與多種基因相互作用發(fā)揮抗HBV作用;PLSCR1可以促進(jìn)TLR9等免疫相關(guān)蛋白表達(dá),進(jìn)而增強細(xì)胞識別并抑制HBV的能力。
【關(guān)鍵詞】：磷脂爬行酶1 乙型肝炎病毒 抗病毒
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 英文縮寫字中英文全稱對照表4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 實驗一 抑制PLSCR1對HBV復(fù)制的影響14-31
• 實驗材料14-17
• 實驗方法17-24
• 實驗結(jié)果24-31
• 實驗二 PLSCR1對細(xì)胞功能的影響31-35
• 實驗材料31
• 實驗方法31-33
• 實驗結(jié)果33-35
• 實驗三 PLSCR1通過PPARA影響HBV的復(fù)制35-40
• 實驗材料35
• 實驗方法35-37
• 實驗結(jié)果37-40
• 實驗四 PLSCR1通過TLR9影響HBV的復(fù)制40-43
• 實驗材料40
• 實驗方法40-42
• 實驗結(jié)果42-43
• 討論43-47
• 結(jié)論47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 附錄54-61
• 附錄1 引物序列54-55
• 附錄2 綜述55-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 附錄3 在校期間論文論著和科研情況61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 傅磊，吳雪，孔玉英，，汪垣;乙肝病毒增強子對其基因表達(dá)的調(diào)控[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;1996年06期

  本文關(guān)鍵詞：磷脂爬行酶1抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：424457