發(fā)布時間：2017-06-05 08:07

  本文關(guān)鍵詞：重組人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達及體外抗腫瘤活性初步分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白細胞介素-29(Interleukin-29,IL-29),通過與其受體結(jié)合來起始信號轉(zhuǎn)導并發(fā)揮生物學效應(yīng),由于IL-29與Ⅰ型IFN激活相同的JAK-STAT信號通路,因而兩者具有相同的生物學活性:如免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等;同時IL-29的受體具有組織分布特異性,其靶細胞有限:如上皮細胞、胃腸細胞和肝細胞等,因而其可以有效地降低毒副作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,IL-29有望成為替代IFN-α用于治療病毒感染和腫瘤的具有臨床療效高且副作用小特性的新型干擾素類藥物。通過分析IL-29的三級結(jié)構(gòu)并將其與IL-28B的晶體結(jié)構(gòu)進行比對,發(fā)現(xiàn)在h IL-29的空間構(gòu)象中的螺旋A和F中的4個氨基酸殘基(Lys-33、Arg-35、Lys-43和Ala-143)是影響其抗腫瘤活性的關(guān)鍵位點。通過結(jié)合自由能和疏水性的分析,選取Lys-33和Arg-35這兩個位點進行定點改造,最終構(gòu)建3個h IL-29變異體。利用大引物PCR方法擴增出h IL-29變異體成熟肽基因(h IL-29mut),經(jīng)一系列質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化以及篩選的步驟后,最終獲得畢赤酵母高產(chǎn)h IL-29mut菌株;經(jīng)酵母基因組鑒定、SDS-PAGE和Western Blotting分析,成功獲得GS115/p PIC9KM-h IL-29mut工程菌株。通過正交試驗的方法,獲得最佳的誘導條件:BMMY初始p H值為7.0、甲醇添加量為1.5%、在26℃條件下誘導60小時。在此條件下進行誘導表達,其發(fā)酵上清的A450值達1.778,是誘導優(yōu)化前發(fā)酵上清A450值的1.81倍。對發(fā)酵產(chǎn)物進行一系列分離純化,純化后的重組蛋白rh IL-29mut(K33R、R35K和K33R/R35K)的HPLC純度分別為98.59%,97.62%和98.12%。初步的抗腫瘤活性分析表明,三者對BEL-7402、HCT-8和SGC-7901細胞增殖均有良好的抑制作用,且其增殖抑制效果優(yōu)于野生型的rh IL-29。在這3個獲得的重組蛋白中,K33R/R35K的抗腫瘤細胞增殖作用最為顯著,在高劑量組(1000 ng/m L)給藥條件下,對上述三株腫瘤細胞的抑制率分別為40.09±2.81%,38.11±2.67%和29.31±2.14%。
【關(guān)鍵詞】：人白細胞介素-29 定點突變 克隆表達 分離純化 抗增殖活性
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-17
• 1.1 IFN-λs的概況8
• 1.2 白細胞介素-29 的基因構(gòu)成8
• 1.3 白細胞介素-29 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)8-10
• 1.4 白細胞介素-29 的來源和表達10-11
• 1.5 白細胞介素-29 的受體和靶細胞11
• 1.6 白細胞介素-29 的信號傳導11-13
• 1.7 白細胞介素-29 的生物學活性13-14
• 1.7.1 白細胞介素-29 的抗病毒活性13
• 1.7.2 白細胞介素-29 的抗增殖活性13-14
• 1.7.3 白細胞介素-29 免疫調(diào)節(jié)活性14
• 1.8 白細胞介素-29 的克隆表達和應(yīng)用14-15
• 1.9 立題意義和主要內(nèi)容15-17
• 1.9.1 立題意義15
• 1.9.2 主要內(nèi)容15-17
• 第二章 人白介素-29 變異體基因（hIL-29mut）的克隆表達17-40
• 2.1 引言17
• 2.2 實驗材料17-19
• 2.2.1 質(zhì)粒與菌株17
• 2.2.2 主要試劑17
• 2.2.3 主要儀器17-18
• 2.2.4 常用試劑的配制18
• 2.2.5 培養(yǎng)基18-19
• 2.3 實驗方法19-29
• 2.3.1 hIL-29 變異體突變位點的確定19
• 2.3.2 引物的設(shè)計與合成19-20
• 2.3.3 hIL-29 變異體成熟肽基因的擴增20-21
• 2.3.4 重組克隆載體pUCm-T-hIL-29mut的構(gòu)建21-22
• 2.3.5 重組表達載體pPIC9KM-hIL-29mut的構(gòu)建22-24
• 2.3.6 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化24
• 2.3.7 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選24-26
• 2.3.8 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定26
• 2.3.9 重組畢赤酵母的誘導條件優(yōu)化26-27
• 2.3.10 重組蛋白rhIL-29mut的分離純化27-29
• 2.4 結(jié)果與討論29-40
• 2.4.1 hIL-29 變異體突變位點的確定29-31
• 2.4.2 hIL-29 變異體成熟肽基因的擴增31-32
• 2.4.3 重組克隆載體pUCm-T-hIL-29mut的構(gòu)建32
• 2.4.4 重組表達載體pPIC9KM-hIL-29mut的構(gòu)建32-33
• 2.4.5 重組畢赤酵母菌株的篩選33
• 2.4.6 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定33-34
• 2.4.7 重組畢赤酵母的誘導條件優(yōu)化34-37
• 2.4.8 重組蛋白rhIL-29mut的分離純化37-40
• 第三章 人白介素-29 變異體（rhIL-29mut）的抗腫瘤活性分析40-47
• 3.1 引言40
• 3.2 實驗材料40-41
• 3.2.1 細胞株40
• 3.2.2 主要試劑40
• 3.2.3 主要儀器40-41
• 3.3 實驗方法41-42
• 3.3.1 細胞的復蘇41
• 3.3.2 細胞的消化41
• 3.3.3 細胞的傳代培養(yǎng)41
• 3.3.4 細胞計數(shù)41-42
• 3.3.5 細胞凍存42
• 3.3.6 抗腫瘤活性的測定42
• 3.4 結(jié)果與討論42-47
• 3.4.1 rhIL-29mut對BEL-7402 細胞的抗腫瘤作用42-44
• 3.4.2 rhIL-29mut對HCT-8 細胞的抗腫瘤作用44-45
• 3.4.3 rhIL-29mut對SGC-7901 細胞的抗腫瘤作用45-47
• 主要結(jié)論與展望47-49
• 主要結(jié)論47-48
• 展望48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻50-55
• 附錄A:作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文55-56
• 附錄B:重組變異體蛋白的分離純化結(jié)果56-57
• 附錄C:Cell Counting Kit-8 試劑盒說明書57-58

【參考文獻】

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本文編號：423260