本文關(guān)鍵詞：重組人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及體外抗腫瘤活性初步分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白細(xì)胞介素-29(Interleukin-29,IL-29),通過與其受體結(jié)合來起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),由于IL-29與Ⅰ型IFN激活相同的JAK-STAT信號通路,因而兩者具有相同的生物學(xué)活性:如免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等;同時(shí)IL-29的受體具有組織分布特異性,其靶細(xì)胞有限:如上皮細(xì)胞、胃腸細(xì)胞和肝細(xì)胞等,因而其可以有效地降低毒副作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,IL-29有望成為替代IFN-α用于治療病毒感染和腫瘤的具有臨床療效高且副作用小特性的新型干擾素類藥物。通過分析IL-29的三級結(jié)構(gòu)并將其與IL-28B的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)在h IL-29的空間構(gòu)象中的螺旋A和F中的4個(gè)氨基酸殘基(Lys-33、Arg-35、Lys-43和Ala-143)是影響其抗腫瘤活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。通過結(jié)合自由能和疏水性的分析,選取Lys-33和Arg-35這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)改造,最終構(gòu)建3個(gè)h IL-29變異體。利用大引物PCR方法擴(kuò)增出h IL-29變異體成熟肽基因(h IL-29mut),經(jīng)一系列質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化以及篩選的步驟后,最終獲得畢赤酵母高產(chǎn)h IL-29mut菌株;經(jīng)酵母基因組鑒定、SDS-PAGE和Western Blotting分析,成功獲得GS115/p PIC9KM-h IL-29mut工程菌株。通過正交試驗(yàn)的方法,獲得最佳的誘導(dǎo)條件:BMMY初始p H值為7.0、甲醇添加量為1.5%、在26℃條件下誘導(dǎo)60小時(shí)。在此條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),其發(fā)酵上清的A450值達(dá)1.778,是誘導(dǎo)優(yōu)化前發(fā)酵上清A450值的1.81倍。對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行一系列分離純化,純化后的重組蛋白rh IL-29mut(K33R、R35K和K33R/R35K)的HPLC純度分別為98.59%,97.62%和98.12%。初步的抗腫瘤活性分析表明,三者對BEL-7402、HCT-8和SGC-7901細(xì)胞增殖均有良好的抑制作用,且其增殖抑制效果優(yōu)于野生型的rh IL-29。在這3個(gè)獲得的重組蛋白中,K33R/R35K的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用最為顯著,在高劑量組(1000 ng/m L)給藥條件下,對上述三株腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為40.09±2.81%,38.11±2.67%和29.31±2.14%。
【關(guān)鍵詞】：人白細(xì)胞介素-29 定點(diǎn)突變 克隆表達(dá) 分離純化 抗增殖活性
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-17
• 1.1 IFN-λs的概況8
• 1.2 白細(xì)胞介素-29 的基因構(gòu)成8
• 1.3 白細(xì)胞介素-29 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)8-10
• 1.4 白細(xì)胞介素-29 的來源和表達(dá)10-11
• 1.5 白細(xì)胞介素-29 的受體和靶細(xì)胞11
• 1.6 白細(xì)胞介素-29 的信號傳導(dǎo)11-13
• 1.7 白細(xì)胞介素-29 的生物學(xué)活性13-14
• 1.7.1 白細(xì)胞介素-29 的抗病毒活性13
• 1.7.2 白細(xì)胞介素-29 的抗增殖活性13-14
• 1.7.3 白細(xì)胞介素-29 免疫調(diào)節(jié)活性14
• 1.8 白細(xì)胞介素-29 的克隆表達(dá)和應(yīng)用14-15
• 1.9 立題意義和主要內(nèi)容15-17
• 1.9.1 立題意義15
• 1.9.2 主要內(nèi)容15-17
• 第二章 人白介素-29 變異體基因（hIL-29mut）的克隆表達(dá)17-40
• 2.1 引言17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.2.1 質(zhì)粒與菌株17
• 2.2.2 主要試劑17
• 2.2.3 主要儀器17-18
• 2.2.4 常用試劑的配制18
• 2.2.5 培養(yǎng)基18-19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 2.3.1 hIL-29 變異體突變位點(diǎn)的確定19
• 2.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成19-20
• 2.3.3 hIL-29 變異體成熟肽基因的擴(kuò)增20-21
• 2.3.4 重組克隆載體pUCm-T-hIL-29mut的構(gòu)建21-22
• 2.3.5 重組表達(dá)載體pPIC9KM-hIL-29mut的構(gòu)建22-24
• 2.3.6 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化24
• 2.3.7 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選24-26
• 2.3.8 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定26
• 2.3.9 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)條件優(yōu)化26-27
• 2.3.10 重組蛋白rhIL-29mut的分離純化27-29
• 2.4 結(jié)果與討論29-40
• 2.4.1 hIL-29 變異體突變位點(diǎn)的確定29-31
• 2.4.2 hIL-29 變異體成熟肽基因的擴(kuò)增31-32
• 2.4.3 重組克隆載體pUCm-T-hIL-29mut的構(gòu)建32
• 2.4.4 重組表達(dá)載體pPIC9KM-hIL-29mut的構(gòu)建32-33
• 2.4.5 重組畢赤酵母菌株的篩選33
• 2.4.6 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定33-34
• 2.4.7 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)條件優(yōu)化34-37
• 2.4.8 重組蛋白rhIL-29mut的分離純化37-40
• 第三章 人白介素-29 變異體（rhIL-29mut）的抗腫瘤活性分析40-47
• 3.1 引言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 3.2.1 細(xì)胞株40
• 3.2.2 主要試劑40
• 3.2.3 主要儀器40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法41-42
• 3.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇41
• 3.3.2 細(xì)胞的消化41
• 3.3.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)41
• 3.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)41-42
• 3.3.5 細(xì)胞凍存42
• 3.3.6 抗腫瘤活性的測定42
• 3.4 結(jié)果與討論42-47
• 3.4.1 rhIL-29mut對BEL-7402 細(xì)胞的抗腫瘤作用42-44
• 3.4.2 rhIL-29mut對HCT-8 細(xì)胞的抗腫瘤作用44-45
• 3.4.3 rhIL-29mut對SGC-7901 細(xì)胞的抗腫瘤作用45-47
• 主要結(jié)論與展望47-49
• 主要結(jié)論47-48
• 展望48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄A:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55-56
• 附錄B:重組變異體蛋白的分離純化結(jié)果56-57
• 附錄C:Cell Counting Kit-8 試劑盒說明書57-58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 柴瑜;羅欣;黃海良;胡道軍;陶自澤;張勝權(quán);;白介素29體外抗乙肝病毒作用[J];中國生化藥物雜志;2009年06期

2 施國民,張錦海,李越希,吳玉章;人白細(xì)胞介素29的cDNA克隆和序列分析[J];中國生物工程雜志;2004年10期

3 惠希武;陳虹;黃秉仁;;IFN-λs的最新研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2010年04期

4 陳偉;于明磊;鄭海軍;郁心;鄔敏辰;吳靜;;人白細(xì)胞介素-29基因的克隆及真核表達(dá)[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年04期

5 鄭海軍;朱榮;葛春蕾;蔡鮮;徐望;陳偉;陸源;;人白細(xì)胞介素-29的生物信息學(xué)分析[J];中國生物制品學(xué)雜志;2013年02期

6 李明才,何韶衡;人白細(xì)胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆與序列分析[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2004年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李明才;人IL-28和IL-29基因的克隆與表達(dá)[D];汕頭大學(xué);2006年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高金湖;人溶菌酶融合基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究[D];江南大學(xué);2010年

2 吳興達(dá);中華絨螯蟹主要致敏原的分離純化與免疫學(xué)鑒定[D];江南大學(xué);2009年

3 鄭海軍;重組人白介素-29在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性分析[D];江南大學(xué);2013年

4 龔燕燕;阿魏酸酯酶A的基因克隆、表達(dá)及應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：重組人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及體外抗腫瘤活性初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：423260