發(fā)布時間：2017-06-01 21:25

  本文關(guān)鍵詞：鞘氨醇激酶2對全反式維甲酸腫瘤抑制活性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase, Sphk)及其代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)的作用備受關(guān)注。作為一種脂類激酶,SphK在細胞遷徙、增殖、凋亡等過程中具有重要的調(diào)控作用。機體內(nèi)的重要脂質(zhì)鞘氨醇可通過Sphk的催化而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写偕L作用的因子S1P,也可通過神經(jīng)酰胺合成酶的作用轉(zhuǎn)變成誘導(dǎo)凋亡作用的因子神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)。S1P/Cer的平衡能夠決定細胞生存還是凋亡,而Sphk是調(diào)節(jié)這一平衡的關(guān)鍵酶,因此Sphk是細胞存亡的重要調(diào)節(jié)者。維甲酸類藥物是維生素A的結(jié)構(gòu)及功能類似物的總稱,這類物質(zhì)對于調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用。維甲酸類藥物的作用主要由核內(nèi)受體維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)介導(dǎo),通過激活RAR/RXR二聚體促進含有RXRs或RARs識別元件的靶基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。維甲酸受體的表達缺失是癌癥發(fā)生過程中的常發(fā)與重要事件,可能導(dǎo)致腫瘤對維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性。本課題旨在將細胞對維甲酸的敏感性高低同鞘氨醇激酶聯(lián)系起來,探討SphK2的下調(diào)能否提高腫瘤細胞對全反式維甲酸的敏感性以及其相關(guān)作用機制。該項研究的對于深入了解鞘脂類代謝產(chǎn)物S1P介導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生對維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性、發(fā)現(xiàn)新靶點和設(shè)計維甲酸衍生物具有指導(dǎo)意義。實驗方法：以小RNA干擾技術(shù)(SiRNA)抑制SphK2表達從而降低SphK2和S1P水平,以克隆形成法檢測加入S1P以及干擾SphK2對HT-29細胞生長的影響,并檢測ATRA對野生型HT-29以及SiSphK2處理HT-29細胞的生長抑制能力。以流式細胞儀檢測S1P升高和降低分別對ATRA所致的細胞G1期阻滯和細胞凋亡作用的影響。以Western blotting法和實時定量PCR法檢測S1P對ATRA誘導(dǎo)細胞RARp表達的影響以及相關(guān)周期、凋亡和PI3K/AKT等細胞通路的影響。實驗結(jié)果:Western blotting以及real-time PCR結(jié)果表明SiRNA能特異性降低SphK2水平約80%,且在96h內(nèi)能夠保持在對照組的20-30%。0.1μM的S1P能夠拮抗10μM ATRA引起的HT-29細胞增殖抑制、受體RARβ的表達、細胞G1期阻滯和細胞凋亡；相反,SphK2干擾降低細胞SphK2水平和S1P水平,從而增強ATRA引起的細胞增值抑制、受體RARβ的表達、細胞G1期阻滯和細胞凋亡。Western blotting結(jié)果表明其作用與細胞凋亡通路、P53/p21Wafl/Cipl和EGFR以及PI3K/AKT信號通路相關(guān)。實驗結(jié)論：細胞中S1P高水平能夠拮抗ATRA引起的靶基因的轉(zhuǎn)錄和受體表達,從而導(dǎo)致腫瘤細胞對ATRA產(chǎn)生耐藥性。相反,干擾SphK2基因使其在細胞中水平降低從而降低S1P水平,能夠提高腫瘤細胞對ATRA的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 鞘氨醇激酶2 鞘氨醇-1-磷酸 全反式維甲酸 RARβ
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 符號說明12-14
• 前言14-25
• 1 鞘氨醇激酶與鞘脂代謝14-18
• 1.1 鞘脂代謝14-15
• 1.2 “鞘脂開關(guān)”15-16
• 1.3 鞘脂代謝物在細胞存亡與癌癥中的作用16-17
• 1.4 鞘脂代謝相關(guān)激酶17-18
• 2 維甲酸18-23
• 2.1 維甲酸來源與活性18-19
• 2.2 ATRA受體及其基因組活性19-21
• 2.3 ATRA非基因組活性21-22
• 2.4 維甲酸受體缺失與腫瘤22-23
• 3 S1P與SphK對維甲酸活性的影響23-25
• 材料與方法25-46
• 1 實驗材料25-32
• 1.1 化合物25
• 1.2 細胞株及其培養(yǎng)25
• 1.3 試劑25-28
• 1.4 儀器設(shè)備28
• 1.5 試劑配置28-32
• 2 實驗方法32-37
• 2.1 克隆形成抑制實驗32-33
• 2.2 基因干擾實驗33
• 2.3 細胞周期檢測33
• 2.4 Annexin V-FITC/PI雙染實驗33-34
• 2.5 Western blotting檢測相關(guān)蛋白34-35
• 2.6 RT-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA水平35-37
• 2.7 數(shù)據(jù)分析37
• 3 實驗結(jié)果37-46
• 3.1 SiRNA干擾細胞內(nèi)SphK2表達情況37-38
• 3.2 SphK2/S1P影響ATRA對HT-29抑制活性38-39
• 3.3 SphK2/S1P影響ATRA對HT-29周期抑制活性39-40
• 3.4 Western Blotting檢測周期相關(guān)蛋白表達量40-41
• 3.5 SphK2/S1P影響ATRA對HT-29細胞凋亡活性41-42
• 3.6 Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白表達量42-43
• 3.7 S1P拮抗ATRA誘導(dǎo)的RARβ受體表達43
• 3.8 RT-PCR檢測SiSphK2對ATRA誘導(dǎo)RARβ表達的影響43-44
• 3.9 Western Blotting檢測SiSphK2對ATRA誘導(dǎo)RARβ表達的影響44-45
• 3.10 Western Blotting檢測對相關(guān)信號通路的影響45-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48-50
• 參考文獻50-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文58-59
• 附件59

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