本文關(guān)鍵詞：HER2抑制劑TAK165協(xié)同全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞分化的藥效及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是一種血液系統(tǒng)腫瘤,嚴(yán)重威脅人類生命健康。AML的重要標(biāo)志是存在嚴(yán)重的髓系分化障礙。所以,目前認(rèn)為可以將誘導(dǎo)分化治療作為臨床治療AML的一種有效的治療策略。全反式維甲酸(All-transretinoic acid,ATRA)是第一個(gè)成功用于臨床治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL, AML型M3)的分化誘導(dǎo)劑。然而,APL患者在大量使用ATRA時(shí)會(huì)出現(xiàn)全反式維甲酸耐藥、復(fù)發(fā)等現(xiàn)象,同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)。此外,ATRA除了對(duì)APL患者有較好的療效,對(duì)于AML的其他亞型,都沒有顯著的治療效果。因此,尋找更為高效低毒的誘導(dǎo)分化藥物或采用藥物聯(lián)合方案完善維甲酸誘導(dǎo)分化治療策略是解決上述問題的關(guān)鍵途徑。人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)是ErbB家族中的重要成員,參與細(xì)胞生長(zhǎng),增殖,粘附和分化等重要生命過程的調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道,抑制HER2的信號(hào)通路對(duì)白血病可能有潛在的治療作用。TAK165 (Mubritinib)是一種HER2的特異抑制劑,其應(yīng)用于腫瘤的治療目前仍處于臨床研究階段。有文獻(xiàn)報(bào)道,TAK165可以通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而針對(duì)包括AML在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。但是,關(guān)于TAK165調(diào)控ATRA介導(dǎo)的AML細(xì)胞分化目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本課題擬通過實(shí)驗(yàn)研究HER2抑制劑TAK165 (Mubritinib)與ATRA聯(lián)合應(yīng)用,誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化效應(yīng),并進(jìn)一步探討其內(nèi)在的分子機(jī)制。研究方法：選用人白血病細(xì)胞株HL60和NB4為主要研究對(duì)象,考察TAK165對(duì)于AML細(xì)胞的增殖以及周期分布的影響,并檢測(cè)TAK165與ATRA合用對(duì)于AML細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和存活率曲線；細(xì)胞經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞周期分布的變化情況；應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和分化相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27、C/EBPβ、PU.1)的表達(dá)；細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CDllb的表達(dá)；應(yīng)用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原法檢測(cè)細(xì)胞分化能力；應(yīng)用瑞氏-吉姆薩染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分化相關(guān)因子(PU.1, C/EBPB、C/EBPE)的mRNA表達(dá)水平；選用人白血病細(xì)胞株HL60和NB4為主要研究對(duì)象,考察TAK165和ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的分子機(jī)制。細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CDllb的表達(dá)；應(yīng)用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原法檢測(cè)細(xì)胞分化能力；應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RARB、PXN的mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用Western blot檢測(cè)HER2,RARa蛋白表達(dá)水平,檢測(cè)分化啟動(dòng)因子STAT1表達(dá)及活化水平(STAT1、p-STAT1 S727), MAPK家族蛋白表達(dá)以及活化水平(MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK);利用HER2單克隆抗體藥物赫賽汀研究HER2靶點(diǎn)在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化中的作用。用攜帶pCCL-RARa的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HL60R細(xì)胞,通過過表達(dá)RARa檢測(cè)其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中的作用。用攜帶shRNA-STAT1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞,通過沉默STAT1檢測(cè)其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中的作用。選用MEK/ERK特異性抑制劑PD98059和U0126、p38特異抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125,研究MAPK信號(hào)通路在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中的作用。研究結(jié)果：1)TAK165引起AML細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯,而不會(huì)引起明顯的細(xì)胞死亡。TAK165作用于HL60和NB4細(xì)胞,通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),結(jié)果顯示TAK165會(huì)引起細(xì)胞增殖抑制,而且抑制程度呈劑量依賴性和濃度依賴性,但是不會(huì)引起明顯的細(xì)胞死亡。通過PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布的變化,結(jié)果顯示TAK165能夠使HL60和NB4細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27)的表達(dá)變化,顯示TAK165作用于HL60和NB4細(xì)胞, c-Myc蛋白表達(dá)下調(diào),p21、p27表達(dá)上調(diào),確證了TAK165可以使HL60和NB4細(xì)胞發(fā)生周期阻滯。2)TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細(xì)胞,通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法,計(jì)數(shù)并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明TAK165可以明顯促進(jìn)ATRA引起的HL60和NB4細(xì)胞的增殖抑制作用。通過PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布變化,TAK165可以協(xié)同ATRA使HL60和NB4細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。我們從分子標(biāo)志、生化功能、形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況幾方面確證了TAK165可以增強(qiáng)ATRA引起HL60和NB4細(xì)胞分化的作用。ATRA單獨(dú)作用于HL60和NB4細(xì)胞72小時(shí),CD11b陽(yáng)性率分別為24.8%±3.0%,而TAK165與ATRA聯(lián)合應(yīng)用時(shí),CD11b陽(yáng)性率達(dá)到80.0±3.4%。TAK165與ATRA聯(lián)合作用時(shí),NBT還原能力也較TAK165和ATRA單獨(dú)作用時(shí)明顯增強(qiáng),NBT陽(yáng)性細(xì)胞比例由21.30%±2.45%到93.40%±1.19%。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示,TAK165與ATRA作用于HL60和NB4細(xì)胞,引起細(xì)胞胞體變小,細(xì)胞核固縮,核質(zhì)比例下降,而且TAK165與ATRA合用引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與單用組相比更為明顯。此外,通過Realtime-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞分化相關(guān)基因(CEBPB、CEBPE、PU.1),分化相關(guān)蛋白(C/EBPp、PU.1)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)TAK165與ATRA聯(lián)合作用使分化相關(guān)基因上調(diào),相關(guān)蛋白的表達(dá)增加,確證了TAK165可以協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。3)TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的機(jī)制研究。通過Western blot檢測(cè)HL60和NB4細(xì)胞中HER2蛋白表達(dá),結(jié)果顯示與HER2高表達(dá)的乳腺癌BT474相比,在AML細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到HER2蛋白的表達(dá)。加入HER2單克隆抗體藥物赫賽汀后,PI染色檢測(cè)周期分布結(jié)果顯示,赫賽汀既不能協(xié)同ATRA引起細(xì)胞周期阻滯,也不會(huì)對(duì)TAK165和ATRA引起的G0/G1周期阻滯有明顯的促進(jìn)作用。與之相對(duì)應(yīng)的,加入赫賽汀后,CDllb陽(yáng)性細(xì)胞比率也沒有明顯變化。以上結(jié)果說明,TAK165并不是通過抑制HER2來促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RARa靶基因表達(dá)的結(jié)果顯示,與TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化效應(yīng)一致,在HL60和NB4細(xì)胞中,RARB和PXN在TAK165與ATRA聯(lián)合作用時(shí)均發(fā)生明顯協(xié)同上調(diào)。而在RARα突變的HL60R細(xì)胞中,給藥后RARB和PXN的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。同時(shí),TAK165與ATRA也不會(huì)引起HL60R細(xì)胞分化,CD11b陽(yáng)性率由3.05±0.35%到10.98±0.10%。當(dāng)在HL60R細(xì)胞中過表達(dá)RARa后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)RARB和PXN基因水平發(fā)生了明顯上調(diào),同時(shí)CDllb陽(yáng)性率也從35.33±0.25%增強(qiáng)至67.02±4.94%。以上結(jié)果說明,RARa的激活參與了TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的過程。Western blot結(jié)果顯示,TAK165與ATRA作用于NB4細(xì)胞,協(xié)同上調(diào)了STAT1蛋白S727位點(diǎn)磷酸化水平。慢病毒介導(dǎo)的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了NB4細(xì)胞中STAT1蛋白的表達(dá)水平。通過NBT還原實(shí)驗(yàn)以及CD11b的檢測(cè),結(jié)果顯示STATl的敲除使TAK165對(duì)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的協(xié)同作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果顯示,STAT1的激活在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細(xì)胞時(shí),可以激活MEK/ERK信號(hào)通路,p-MEK、p-ERK蛋白水平均會(huì)協(xié)同上調(diào),而其相應(yīng)原型蛋白水平不變。然而JNK和p38信號(hào)通路在這一過程中不會(huì)被激活,蛋白水平以及磷酸化水平均不變。JNK特異性抑制劑sp600125和p38特異性抑制劑SB203580對(duì)于TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化效應(yīng)影響不大。但是加入MEK特異性抑制劑PD98059,U0126后,TAK165與ATRA合用組細(xì)胞分化水平有明顯的下降,CDllb陽(yáng)性率從82.37%±0.37%到56.22±0.68%,36.5%±2.88%。此外,Western bolt結(jié)果顯示,PD98059和U0126作用與NB4細(xì)胞后,會(huì)明顯抑制TAK165和ATRA合用引起的STAT1蛋白發(fā)生磷酸化激活。以上結(jié)果說明,MEK/ERK信號(hào)通路通過調(diào)控了STAT1的活性,進(jìn)而影響了TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化過程。結(jié)論：本論文較為系統(tǒng)地討論了TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化效應(yīng),并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。研究表明,TAK165可以通過激活MEK/ERK信號(hào)通路,調(diào)控RARa/STAT1軸的激活,進(jìn)而促進(jìn)ATRA對(duì)于HL60和NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)。本研究首次提出TAK165與ATRA協(xié)同可誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,為臨床上髓性白血病的治療提供了一種嶄新的基于誘導(dǎo)分化的聯(lián)合治療策略。
【關(guān)鍵詞】：TAK165(Mubritinib) 全反式維甲酸(ATRA) 急性髓系白血病(AML) 細(xì)胞分化 RARα
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 1 引言17-19
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器19-23
• 2.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒19
• 2.2 藥物與主要試劑19-22
• 2.3 儀器22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)23
• 3.2 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)HL60和NB4細(xì)胞生長(zhǎng)率、存活率23
• 3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL60和NB4細(xì)胞周期分布23
• 3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL60和NB4細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)23-24
• 3.5 NBT細(xì)胞還原能力檢測(cè)24
• 3.6 瑞氏-吉姆薩染色觀察HL60和NB4細(xì)胞核形態(tài)變化24-25
• 3.7 Western Blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白25-26
• 3.8 Realtime-PCR測(cè)定細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的變化26-28
• 3.9 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞28
• 3.10 分離制備胞漿蛋白、核蛋白樣本28-29
• 3.11 數(shù)據(jù)分析29-30
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-62
• 4.1 TAK165可以抑制AML細(xì)胞增殖30-31
• 4.2 TAK165誘導(dǎo)AML細(xì)胞周期阻滯31-33
• 4.3 TAK165可以協(xié)同ATRA抑制AML細(xì)胞增殖33-34
• 4.4 TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞周期阻滯34-35
• 4.5 TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞髓性分化35-41
• 4.6 人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)對(duì)TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的影響41-46
• 4.7 RARα的激活對(duì)于TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的影響46-52
• 4.8 STAT1的激活在TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的過程中,發(fā)揮關(guān)鍵作用52-56
• 4.9 TAK165與ATRA聯(lián)合作用對(duì)于MAPK信號(hào)通路活性的影響56-62
• 5 討論62-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 綜述 基于全反式維甲酸作用機(jī)制的白血病合用治療策略69-85
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 作者簡(jiǎn)介及碩士期間科研成果85-86

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1 賀鵬程;張梅;李靜;蔡瑞波;劉亞琳;曹云新;;Effects of varied interferons in combination with all-trans retinoic acid ( ATRA ) on proliferation and differentiation of ATRA-resistent APL cell[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2006年04期

2 殷小華,馮艷,潘波;ATRA DAP方案治療早幼粒細(xì)胞白血病的臨床研究[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1992年04期

3 黃梅,劉文勵(lì),李春蕊,鄧金牛,周劍鋒,張東華,孫漢英;The Effect of Sodium Butyrate in Combination with ATRA on the Proliferation/Differentiation of SKM-1[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2004年04期

4 ;Down-Regulation of CD44 Contributes to the Differentiation of HL-60 Cells Induced by ATRA or HMBA[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年01期

5 林建樹 ,余英豪;全反視黃酸治療急性早幼粒白血病:初步結(jié)果[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);1993年03期

6 邰秀珍，云鳳仙;ATRA與化療藥物并用治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床觀察[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1994年02期

7 譚立軍,李慧,易靜,湯雪明,沈忠英;EXPERIMENTAL STUDY ON DIMETHYLSULFOXIDEINDUCED DIFFERENTIATION OF HUMAN ESOPHAGEALEPITHELIAL CARCINOMA CELLS[J];Journal of Shanghai Second Medical University;1998年Z1期

8 姜國(guó)勝,唐天華,孫關(guān)林,鄔維禮,趙良玉,任海泉,董強(qiáng),任青華,姜楓勤;EFFECT OF ARSENIC TRIOXIDE OR ATRA ON PRIMARY APL CELL OR HL-60 CELLS AND THEIR VALUE ANALYSIS IN HYPERLEUKOCYTOSIS[J];Chinese Journal of Cancer Research;2001年02期

9 姜國(guó)勝,唐天華,畢可紅,張玉昆,任海泉,姜楓勤,任青華,真剛,劉傳芳,彭軍,郭桂月,劉秀蘭,田志剛;CYTOKINE SECRETION IN PATIENTS WITH ACUTE PROMYELOCYTIC LEUKEMIA AFTER TREATMENT WITH ALLTRANS RETINOIC ACID[J];Chinese Journal of Cancer Research;2003年01期

10 李穎;戴冰冰;蔡蓉;仇全;于麗莉;盧健;;CLONING PROMOTER OF HUMAN SATBl GENE AND EFFECT OF ATRA AND CoCl_2 ON ITS ACTIVITY[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(外文版);2006年01期

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1 ;ATRA Supresses KLF4 Deacetylation Via Inhibiting Its Interaction with HDAC2 in VSMCs[A];2008年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

2 鄭培p，

本文編號(hào)：408264