本文關(guān)鍵詞：脂肪酶BCLA和CALB在合成替卡格雷及依折麥布手性藥物中間體上的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂肪酶是生物催化中使用最廣泛的一類生物催化劑,利用脂肪酶手性拆分酯類藥物中間體是合成手性藥物的重要方法。洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶A(BCLA)和南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)是脂肪酶家族中研究較多、作用機(jī)理清楚的兩種脂肪酶,對(duì)外消旋體具有較強(qiáng)的催化活性和立體選擇性,在合成手性藥物中間體中具有良好的應(yīng)用前景。本文利用脂肪酶BCLA和CALB對(duì)替卡格雷和依折麥布中間體手性拆分的進(jìn)行了研究。我們將BCLA的基因克隆到pET28(a+)載體中,在大腸桿菌中進(jìn)行了BCLA表達(dá),形成了包涵體,利用折疊酶B的輔助作用成功地實(shí)現(xiàn)了包涵體脂肪酶A的復(fù)性。以替卡格雷中間體3為底物對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,BCLA拆分該藥物中間體的最適溫度為60℃,最適pH為7；Co2+和Mn2+對(duì)酶活具有促進(jìn)作用,加入1mM的相應(yīng)離子可使酶活分別提高1.1和1.27倍。在優(yōu)化的條件下利用BCLA拆分替卡格雷藥物中間體,生成目標(biāo)產(chǎn)物(1S,4R)-順-N-芐氧羰基-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1醇的ee值99%,轉(zhuǎn)化率可達(dá)45.7%。(S)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊酸[(S)-FOA alcohol]是合成依折麥布的關(guān)鍵手性中間體。利用CALB拆分依折麥布中間體對(duì)氟苯甲酰基丁酸酯類衍生物,結(jié)果表明該酶可以高效地催化外消旋內(nèi)酯6-(4-氟苯基)-四氫-吡喃-2-酮水解生成(S)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊酸,其ee值99%,產(chǎn)率為46.7%。利用CALB催化外消旋體6-(4-氟苯基)-四氫-吡喃-2-酮與醇類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了從甲醇到戊醇、異丙醇和叔丁醇的一系列轉(zhuǎn)酯化反應(yīng),證明CALB對(duì)外消旋體6-(4-氟苯基)-四氫-吡喃-2-酮具有較好的轉(zhuǎn)酯化活性。
【關(guān)鍵詞】：洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶A 南極假絲酵母脂肪酶B 手性拆分 (1S 4R)-順-N-芐氧羰基-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1醇 6-(4-氟苯基)-四氫-吡喃-2-酮
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-17
• 第一章 緒論17-31
• 1.1 脂肪酶概述17-20
• 1.1.1 脂肪酶定義17
• 1.1.2 脂肪酶的來源17-19
• 1.1.3 脂肪酶的應(yīng)用19-20
• 1.2 常見的兩種脂肪酶20-23
• 1.2.1 Burkholderia cepacia脂肪酶的概述20-21
• 1.2.2 Candida antarctica脂肪酶概述21-23
• 1.3 手性藥物23-25
• 1.3.1 手性藥物的研究現(xiàn)狀23-24
• 1.3.2 手性藥物的制備方法24-25
• 1.4 關(guān)于幾種手性藥物中間體25-29
• 1.4.1 替卡格雷和4-氨基2-環(huán)戊烯-1-醇25-27
• 1.4.2 依折麥布和對(duì)氟苯甲酰基丁酸27-29
• 1.5 課題的研究目的和意義29-31
• 第二章 Burkholderia cepacia脂肪酶和折疊酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達(dá)31-49
• 2.1 引言31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料31-33
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器31-32
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料32
• 2.2.3 培養(yǎng)基32
• 2.2.4 溶液及緩沖液32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 2.3.1 洋蔥伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)及其基因組的提取33
• 2.3.2 脂肪酶A重組質(zhì)粒的構(gòu)建33-36
• 2.3.3 折疊酶B重組質(zhì)粒的構(gòu)建36-37
• 2.3.4 脂肪酶、折疊酶的誘導(dǎo)表達(dá)37-38
• 2.3.5 重組折疊酶B的純化38
• 2.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳38
• 2.3.7 包涵體BCLA的變性與復(fù)性38-39
• 2.3.8 pNPP法測(cè)定脂肪酶的活力39-40
• 2.3.9 測(cè)定BCLA蛋白質(zhì)含量40-41
• 2.4 結(jié)果分析與討論41-47
• 2.4.1 Burkholderia cepacia基因組的檢測(cè)41
• 2.4.2 BCLA和BCLB基因克隆41-42
• 2.4.3 pMD18T-BCLA/BCLB質(zhì)粒構(gòu)建42
• 2.4.4 大腸桿菌表達(dá)載體pET28(a+)-BCLA和pET28(a+)-BCLB重組質(zhì)粒的構(gòu)建42-43
• 2.4.5 大腸桿菌基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)43-44
• 2.4.6 脂肪酶A的純化44
• 2.4.7 重組折疊酶B的純化44-45
• 2.4.8 包涵體BCLA的變性與復(fù)性45-47
• 2.5 本章小結(jié)47-49
• 第三章 BCLA對(duì)替卡格雷中間體拆分活性的研究49-61
• 3.1 引言49
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料49
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器49
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料49
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法49-51
• 3.3.1 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體150
• 3.3.2 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體250
• 3.3.3 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體350
• 3.3.4 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體450
• 3.3.5 BCLA底物譜的研究50-51
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論51-58
• 3.4.1 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體151-52
• 3.4.2 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體252-53
• 3.4.3 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體353
• 3.4.4 BCLA拆分替卡格雷藥物中間體453-54
• 3.4.5 BCLA對(duì)其他藥物中間體拆分的研究54-58
• 3.5 本章小結(jié)58-61
• 第四章 BCLA拆分替卡格雷中間體反應(yīng)條件的優(yōu)化61-67
• 4.1 引言61
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料61
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器61
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料61
• 4.2.3 溶液及緩沖液61
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 4.3.1 最適溫度的測(cè)定61-62
• 4.3.2 最適pH的測(cè)定62
• 4.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活的影響62
• 4.3.4 最適反應(yīng)時(shí)間62
• 4.3.5 在最適條件下的底物拆分結(jié)果62-63
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論63-66
• 4.4.1 最適溫度的測(cè)定63
• 4.4.2 最適pH的測(cè)定63-64
• 4.4.3 不同離子對(duì)底物拆分的影響64-65
• 4.4.4 最適反應(yīng)時(shí)間65
• 4.4.5 在最適條件下的底物拆分結(jié)果65-66
• 4.5 本章小結(jié)66-67
• 第五章 依折麥布外消旋中間體的合成及檢測(cè)條件確定67-75
• 5.1 引言67
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料67
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器67
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料67
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法67-70
• 5.3.1 依折麥布中間體1的合成68-69
• 5.3.2 依折麥布中間體2的合成69
• 5.3.3 依折麥布中間體3的合成69-70
• 5.3.4 依折麥布中間體對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)條件的確定70
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論70-73
• 5.4.1 依折麥布中間體1的合成70
• 5.4.2 依折麥布中間體2的合成70-71
• 5.4.3 依折麥布中間體3的合成71
• 5.4.4 依折麥布中間體對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)條件的確定71-73
• 5.5 本章小結(jié)73-75
• 第六章 脂肪酶CALB拆分依折麥布中間體的研究75-81
• 6.1 引言75
• 6.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料75
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器75
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)材料75
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法75-76
• 6.3.1 CALB對(duì)依折麥布中間體水解反應(yīng)的研究75-76
• 6.3.2 CALB對(duì)依折麥布中間體1轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的研究76
• 6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論76-79
• 6.4.1 CALB對(duì)依折麥布中間體水解反應(yīng)的研究76-78
• 6.4.2 CALB對(duì)依折麥布中間體轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的研究78-79
• 6.5 本章小結(jié)79-81
• 第七章 總結(jié)與展望81-83
• 參考文獻(xiàn)83-87
• 附錄87-97
• 致謝97-99
• 研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文99-101
• 作者與導(dǎo)師簡(jiǎn)介101-102
• 碩士研究生學(xué)位論文答辯委員會(huì)決議書102-103

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張搏;楊江科;閆云君;;假單胞菌脂肪酶的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2007年02期

2 王炳強(qiáng);;手性化合物與對(duì)映體藥物拆分的進(jìn)展[J];天津化工;2006年04期

3 徐剛;程詠梅;吳堅(jiān)平;楊立榮;;有機(jī)相酶催化拆分制備(S)-2-氯-1-(2-噻吩)-乙醇[J];有機(jī)化學(xué);2007年07期

  本文關(guān)鍵詞：脂肪酶BCLA和CALB在合成替卡格雷及依折麥布手性藥物中間體上的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：400027