發(fā)布時間：2017-05-23 20:09

  本文關(guān)鍵詞：MiR-181c對耐順鉑鼻咽癌細胞凋亡的作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.驗證耐藥鼻咽癌細胞HNE1/DDP的耐藥性。2.檢測鼻咽癌細胞HNE1/DDP和HNE1中mi R-181c表達的差異并且研究其對細胞凋亡的作用。3.探討mi RNA影響鼻咽癌細胞凋亡的機制。方法:1.MTT法檢測不同濃度順鉑(DDP)對兩株細胞HNE1和HNE1/DDP的增殖抑制的影響;根據(jù)24、48、72h的IC50值確定耐藥株細胞的耐藥指數(shù);鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP中抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和Bim的蛋白表達水平則采用Western blot實驗方法檢測,進一步驗證耐藥株細胞的耐藥性。2.根據(jù)課題組之前的Micro RNA(mi RNA)芯片結(jié)果篩選出差異表達的mi R-181c,并采用熒光定量RT-PCR方法驗證表達的差異。3.分別將類似物mi R-181c mimics、抑制劑mi R-181c inhibitors轉(zhuǎn)染到表達量低的HNE1/DDP和表達量較高的HNE1細胞株中,RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后mi R-181c在兩株細胞中的表達情況;MTT法檢測轉(zhuǎn)染mi R-181c mimics和inhibitors后對兩株細胞增殖抑制的影響;集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法檢測兩株細胞凋亡的變化。4.采用Western blot方法檢測mi R-181c的調(diào)控對Mcl-1基因在兩株細胞中的表達的影響;轉(zhuǎn)染Mcl-1 si RNA,集落克隆和Annexin V/PI雙染法檢測凋亡的變化。結(jié)果:1.鼻咽癌細胞HNE1/DDP相對親本細胞HNE1具有耐藥的特性(1)MTT法顯示:在24、48、72h,不同濃度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)作用于鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP能夠抑制其增殖,且呈時間和濃度依賴性。在24、48、72h,鼻咽癌細胞HNE1/DDP的半數(shù)抑制率(IC50)計算后得出分別為32.15±0.37、21.88±0.49、14.76±0.56μmol·L-1,鼻咽癌細胞HNE1的IC50為7.87±0.33、5.25±0.15、3.45±0.35μmol·L-1。鼻咽癌細胞HNE1/DDP耐藥指數(shù)(RI)計算后得出為4.08、4.16、4.27。從計算得出的IC50以及RI可以看出,耐藥株細胞HNE1/DDP是符合耐藥株的條件的,耐藥株的耐藥性得以驗證。(2)Western blot和熒光定量PCR結(jié)果同時顯示:在耐藥株HNE1/DDP細胞中,抗凋亡蛋白以及抗凋亡基因MRP、Bcl-2表達升高,促凋亡蛋白和促凋亡基因Bax、Bim表達下降。2.mi R-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表達具有差異課題組前期的mi RNA芯片結(jié)果顯示,mi R-181c在兩株細胞中的表達具有差異,我們采用熒光定量RT-PCR驗證結(jié)果顯示,在HNE1中,mi R-181c具有3.5倍的上調(diào)。3.mi R-181c的調(diào)控對鼻咽癌細胞凋亡的影響(1)在低表達mi R-181c的HNE1/DDP細胞中,轉(zhuǎn)染mi R-181c的模擬物使其表達增加,相反地,在高表達mi R-181c的HNE1細胞中,轉(zhuǎn)染mi R-181c抑制劑使其表達減少。轉(zhuǎn)染之后,采用熒光定量RT-PCR再次檢測兩株細胞中的表達情況,結(jié)果證明,mi R-181c類似物可以使細胞中mi R-181c的表達增加,而mi R-181c抑制劑則降低mi R-181c的表達。(2)MTT結(jié)果顯示,mi R-181c抑制劑能明顯增強HNE1細胞耐順鉑能力,mi R-181c模擬物降低HNE1/DDP細胞對順鉑的耐受力。此外,集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法結(jié)果均顯示,mi R-181c抑制劑能明顯降低順鉑作用HNE1細胞的凋亡率,mi R-181c模擬物增加了順鉑作用于HNE1/DDP細胞的凋亡率。4.mi R-181c通過作用于Mcl-1對鼻咽癌細胞的凋亡產(chǎn)生影響(1)Western blot結(jié)果顯示,HNE1/DDP細胞中Mcl-1的表達明顯高于HNE1細胞。(2)Western blot結(jié)果顯示,mi R-181c抑制劑能使HNE1細胞中Mcl-1增加,mi R-181c模擬物能使HNE1/DDP細胞中Mcl-1降低。(3)將Mcl-1 si RNA、陰性對照si RNA轉(zhuǎn)染進鼻咽癌細胞HNE1/DDP中,western blot和q RT-PCR檢測Mcl-1表達減少,證明成功干擾了Mcl-1的表達。集落克隆結(jié)果可以看出,干擾了Mcl-1的表達后能減少HNE1/DDP細胞集落的形成。此外,PI單染和Annexin V/PI雙染法結(jié)果表明,干擾Mcl-1的表達后能增加順鉑誘導的HNE1/DDP細胞的凋亡率。結(jié)論:1.HNE1/DDP較親本細胞HNE1具有耐藥的特性。2.HNE1和HNE1/DDP細胞中mi R-181c的表達是不同的,降低mi R-181c的表達以后可以降低HNE1細胞由順鉑誘導的凋亡。相反,過表達的mi R-181c能夠增加HNE1/DDP細胞的凋亡。3.Mcl-1的表達受mi R-181c的調(diào)控,降低mi R-181c的表達,Mcl-1表達升高,相反地,增加mi R-181c的表達,Mcl-1的表達下降;Mi R-181c基因過表達增加順鉑誘導的HNE1/DDP細胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 耐藥 microRNA siRNA 細胞凋亡
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 引言11-15
• 材料與方法15-28
• 1. 儀器與材料15
• 1.1 實驗儀器15
• 1.2 試劑15
• 1.3 細胞系15
• 2.實驗方法15-27
• 2.1 細胞培養(yǎng)15-17
• 2.2 MTT法檢測細胞存活率17
• 2.3 細胞轉(zhuǎn)染17-18
• 2.4 溴化吡啶 (propiodide, PI) 染色檢測細胞凋亡18-19
• 2.5 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡19
• 2.6 集落克隆實驗19
• 2.7 熒光定量RT-PCR檢測mRNA表達19-22
• 2.8 熒光定量RT-PCR檢測miRNA的含量22-24
• 2.9 免疫印跡法（western blot）檢測蛋白的表達24-27
• 3. 統(tǒng)計學處理27-28
• 結(jié)果28-38
• 1.鼻咽癌耐藥株細胞HNE1/DDP具有耐藥特性28-30
• 2. miR-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表達具有差異30
• 3.調(diào)控兩株細胞HNE1和HNE1/DDP中miR-181c的表達及其調(diào)控對細胞凋亡的影響30-35
• 4. miR-181c通過介導Mcl-1 對鼻咽癌細胞凋亡的調(diào)控作用35-38
• 討論38-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-50
• 致謝50-51
• 附錄A 英中文術(shù)語縮略語表51-52
• 附錄B 常用試劑配制方法52-55
• 附錄C 個人簡歷及發(fā)表論文55-56
• 附錄D 綜述56-67
• 參考文獻62-67

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