本文關(guān)鍵詞：人與鼠源內(nèi)皮抑素基因合成和原核表達(dá)及功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：血管內(nèi)皮抑素最初是從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)基中分離純化而來,一種內(nèi)源性血管生成抑制劑,是膠原蛋白18C末端的一個片段,能特異性地抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而抑制血管的增生,內(nèi)皮抑素不影響已生成成熟血管的功能,因此是一種理想的新生血管生成抑制劑,在臨床上用于抑制腫瘤血管生成從而達(dá)到腫瘤治療目的,重組內(nèi)皮抑素主要通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得,其中絕大部分是以包涵體形式存在。人與鼠源內(nèi)皮抑素基因具有高度的同源性和相似的生物學(xué)功能。本文將確定人與鼠源內(nèi)皮抑素基因并構(gòu)建不同表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)載體探討內(nèi)皮抑素的可溶性表達(dá)以及驗證重組人源內(nèi)皮抑素對新生血管的抑制作用。方法：根據(jù)文獻(xiàn)報道和NCBI數(shù)據(jù)庫確定Human Endostatin ( IE)和Mouse Endostatin (ME) DNA序列,DNA合成法分別獲得人與鼠源內(nèi)皮抑素基因,加入不同酶切位點設(shè)計引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增后膠回收,分別與攜帶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1和攜帶硫氧還蛋白A(TrxA)表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a進(jìn)行雙酶切處理、T4DNA連接酶連接,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1-HE 和 pET-32a-ME,將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),確定人與鼠源內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達(dá)條件,將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎,離心后上清和沉淀分別進(jìn)行蛋白電泳確定蛋白分布,將內(nèi)皮抑素包涵體洗滌、變性、復(fù)性、濃縮后獲得重組蛋白,最后通過雞胚絨毛尿囊膜實驗驗證人源重組內(nèi)皮抑素蛋白的抗血管生成活性。結(jié)果：測序分析表明成功合成人與鼠源內(nèi)皮抑素基因,通過PCR擴(kuò)增確定人與鼠源內(nèi)皮抑素基因大小為560bp左右,與理論符合,通過分子克隆分別將人與鼠源內(nèi)皮抑素基因連接進(jìn)入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1和pET-32a,經(jīng)PCR、雙酶切、測序分析顯示原核表達(dá)載體pGEX-4T1-HE和 pET-32a-ME構(gòu)建成功,在37℃,1mmol/LIPTG濃度下,大腸桿菌BL21(DE3)中人、鼠源內(nèi)皮抑素成功表達(dá),通過SDS-PAGE分析,與空白組相比,實驗組出現(xiàn)目的條帶,其中人源內(nèi)皮抑素重組蛋白在46 kDa處出現(xiàn),鼠源內(nèi)皮抑素重組蛋白在39 kDa處出現(xiàn),與理論相符,人與鼠源內(nèi)皮抑素主要以包涵體形式表達(dá),在破碎后的菌體上清中沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素的分布,通過對包涵體的洗滌、純化、復(fù)性獲得人與鼠源重組內(nèi)皮抑素蛋白,在雞胚絨毛尿囊膜實驗中,與對照組相比,實驗組的血管數(shù)少,血管管徑細(xì)。結(jié)論：研究結(jié)果表明獲得了長度為554 bp的人源內(nèi)皮抑素基因和長度為565 bp的鼠源內(nèi)皮抑素基因,成功構(gòu)建了人與鼠源內(nèi)皮抑制素基因不同標(biāo)簽表達(dá)載體,在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)。成功獲得人與鼠源ES重組蛋白；CAM實驗結(jié)果也證明了純化復(fù)性后的人源重組蛋白能明顯抑制新生血管的生長。我們的研究結(jié)果也表明TrxA標(biāo)簽和GST標(biāo)簽對增進(jìn)重組ES可溶表達(dá)沒有顯著差異,兩組標(biāo)簽的重組蛋白都主要存在于包涵體內(nèi)。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮抑素 基因合成 重組蛋白 純化 蛋白標(biāo)簽 雞胚絨毛尿囊膜試驗
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5;R96
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 英文縮略語表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一節(jié) 人、鼠源內(nèi)皮抑素原核表達(dá)載體構(gòu)建14-36
• 1.實驗材料14-16
• 2.實驗方法16-28
• 3.結(jié)果28-34
• 4 討論34-35
• 5 結(jié)論35-36
• 第二節(jié) 人、鼠源內(nèi)皮抑制素不同標(biāo)簽重組蛋白的表達(dá)純化及活性分析36-47
• 1.實驗材料36-39
• 2.實驗方法39-40
• 3.結(jié)果40-44
• 4 討論44-46
• 5 結(jié)論46-47
• 課題綜述47-59
• 參考文獻(xiàn)59-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄70
• 感謝以下基金對本課題資助70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：人與鼠源內(nèi)皮抑素基因合成和原核表達(dá)及功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：384852