本文關鍵詞：重組人神經(jīng)生長因子的真核表達及初步活性鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)的、且至今研究最為清楚的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子,該因子具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促進突起生長等多種生物學功能。而且近年研究發(fā)現(xiàn),NGF不僅局限于中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng),還在褥瘡、角膜潰瘍、青光眼,甚至在免疫性疾病的治療中發(fā)揮著積極的作用。目前臨床上應用最廣泛的是鼠源性NGF,然而其生產(chǎn)方法和成品的缺點不容忽視,易引起過敏反應及誘發(fā)中和抗體反應;可能被病毒污染;工藝復雜,無法實現(xiàn)自動化,生產(chǎn)成本高,且成藥價格高居不下,這引起我們的關注。另一方面,盡管研究者們嘗試通過多種方法和從不同系統(tǒng)中利用重組藥物技術生產(chǎn)重組人NGFβ亞基(rh-β-NGF),但是采用原核表達系統(tǒng)或者與人類物種差異很大的昆蟲系統(tǒng),難以得到高生物學活性的重組NGF。即便采用真核表達系統(tǒng),由于缺乏重組載體構建的完備性,導致生產(chǎn)效率相對低下。因此,我們嘗試構建一種高效穩(wěn)定的重組人NGF真核表達載體,通過增加一些轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件、更換信號肽序列,并檢測人NGF的表達水平并鑒定其生物學活性,為大規(guī)模生產(chǎn)NGF奠定基礎。1、成功建立高效、穩(wěn)定的重組人NGF的真核表達系統(tǒng)及純化其表達產(chǎn)物首先,構建重組質(zhì)粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr,由5部分組成,包括CMV啟動子、β球蛋白基因內(nèi)含子、人β-NGF基因、內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)和篩選標記基因(Dihydrofolate Reductase,dhfr)。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞系,用MTX篩選和有限稀釋法進行克隆選擇,獲得高效表達rh NGF的單克隆重組細胞株。結果顯示,重組細胞在形態(tài)上與普通HEK293細胞相同,生長方式、速度和凋亡率與重組前相似,兩者無明顯不同。隨后逐步降低血清培養(yǎng),最終使細胞株完全適應無血清培養(yǎng)基,并穩(wěn)定表達rh NGF(即rh-β-NGF,本文中rh NGF均指rh-β-NGF)。利用SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物,可見相對分子質(zhì)量約13 k Da的條帶,純度大于50%,經(jīng)質(zhì)譜法測定得到其肽圖譜與理論序列完全匹配,接著我們利用SP Sepharose FF強陽離子層析柱純化rh NGF,得到rh NGF蛋白純度95%;最后進行重組細胞株表達效率和表達穩(wěn)定性檢測,結果表明重組細胞株經(jīng)歷60次傳代后仍能穩(wěn)定生長,并高效表達rh NGF,分泌效率為50-100 mg/L培養(yǎng)基上清,約為20-50 pg/(cell?d)。2、重組人NGF經(jīng)初步鑒定發(fā)現(xiàn)具有多方面活性良好生物學活性的rh NGF才具臨床藥用價值,因此我們通過分析rh NGF對PC12細胞分化、雞胚背根神經(jīng)節(jié)細胞和小鼠鼠頸上神經(jīng)節(jié)生長的影響,以及經(jīng)rh NGF處理后小鼠體內(nèi)一系列指標的變化,來鑒定其生物學活性。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)系,是一類具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的細胞系,培養(yǎng)簡單,傳代方便,因而被廣泛應用于神經(jīng)藥理和神經(jīng)生理學相關領域研究[1,2],誘導PC12細胞分化是檢測NGF生物學活性的經(jīng)典方法。我們常規(guī)培養(yǎng)PC12細胞,至其生長至90%單層時,按終濃度5μg/m L加入鼠源性神經(jīng)生長因子(m NGF)和rh NGF,并以PBS做陰性對照,結果發(fā)現(xiàn)rh NGF組較陰性對照組能生長出更多纖維狀突起,說明重組細胞株所分泌的rh NGF具有誘導PC12細胞分化的生物學活性活性。雞胚背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglia,DRG)細胞增殖實驗是檢測神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的主要方法,也是鑒定NGF生物學活性的常用實驗。我們解剖出8 d齡雞胚的DRG,放置培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待神經(jīng)節(jié)細胞貼壁生長,換入新鮮培養(yǎng)液,加入PBS、m NGF、rh NGF,觀察細胞生長情況。24 h各組均有細胞遷出,而48 h后rh NGF組更多細胞的遷出,并形成類神經(jīng)突起,m NGF組同樣也有明顯改變,遷出細胞長勢良好,而在PBS組中DRG細胞生長明顯雜亂無序,且可見凋亡現(xiàn)象。這些結果表明m NGF、rh NGF有神經(jīng)元營養(yǎng)和促神經(jīng)細胞生長的作用。進一步檢測rhNGF對新生小鼠皮膚Trk A表達水平,以及頸上神經(jīng)節(jié)生長的影響,分析其生物學活性。通過頸部皮膚注射rh NGF,利用Western Blot法檢測新生小鼠頸部皮膚Trk A表達量。結果發(fā)現(xiàn),rh NGF與m NGF均能夠明顯升高小鼠頸部皮膚Trk A表達量,且效果相似。同時,雙側(cè)頸部皮膚Trk A表達水平均出現(xiàn)升高,但沒有統(tǒng)計學差異,提示rh NGF不僅在注射部位發(fā)揮作用,也能夠上調(diào)遠離注射部位皮膚的Trk A,因此rhNGF能夠在全身發(fā)揮作用。肥大細胞可分泌神經(jīng)生長因子,后者與肥大細胞膜上NGF受體Trk A結合,通過第二信使Ca2+誘導肥大細胞自身活化并脫顆粒,釋放一些炎性介質(zhì)和組胺等作用于神經(jīng)末梢促使后者釋放神經(jīng)遞質(zhì)[4,5]。我們通過分析經(jīng)藥物處理后新生鼠皮膚組織的肥大細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)rh NGF和m NGF處理的兩組,肥大細胞聚集并且脫顆粒,說明rh NGF能與肥大細胞膜上特異受體結合并發(fā)揮作用。進一步解剖分離出各組新生鼠頸上神經(jīng)節(jié)(Superior Cervical Ganglia,SCG),于顯微鏡下測定SCG短徑a和長徑b,采用1/2×a×a×b的方法計算SCG體積,進行統(tǒng)計學分析。結果發(fā)現(xiàn),注射rh NGF組和m NGF組的SCG對比陰性對照組體積明顯增大。分析雙側(cè)SCG體積,發(fā)現(xiàn)注射rh NGF和m NGF能夠同時增加新生鼠雙側(cè)SCG體積。通過HE染色對小鼠SCG進行組織學分析,發(fā)現(xiàn)兩NGF組SCG神經(jīng)元較之PBS組呈肥大生長且數(shù)量增多。綜合以上結果,我們建立的細胞株能高效穩(wěn)定表達rh NGF,并且在體外和體內(nèi)均具有類似于藥用m NGF同樣的活性。本研究為rh NGF的臨床應用提供研究材料和實驗數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：重組 神經(jīng)生長因子 真核載體 HEK293細胞 活性鑒定
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R927;R96
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-21
• 1 神經(jīng)生長因子的臨床應用15-18
• 2 神經(jīng)生長因子的生產(chǎn)方法18-21
• 第一部分 重組人神經(jīng)生長因子真核表達系統(tǒng)的建立21-35
• 引言21
• 1 主要材料、試劑21-22
• 2 實驗方法22-28
• 3 結果28-33
• 4 討論33-35
• 第二部分 重組人神經(jīng)生長因子的活性鑒定35-48
• 引言35
• 1 主要材料、試劑35-36
• 2 實驗方法36-39
• 3 結果39-45
• 4 討論45-48
• 小結48-50
• 參考文獻50-57
• 個人簡歷和研究成果57-58
• 致謝58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 仝進毅;張信美;林俊;;神經(jīng)生長因子及其受體與子宮內(nèi)膜異位癥疼痛機制[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2010年01期

2 葉蘭萍;武元元;曹廣通;;神經(jīng)生長因子促進燙傷創(chuàng)面釋放內(nèi)源性生長因子[J];中國組織工程研究;2013年28期

  本文關鍵詞：重組人神經(jīng)生長因子的真核表達及初步活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：380696