本文關(guān)鍵詞：脂質(zhì)納米粒介導(dǎo)的基因與化藥聯(lián)合治療乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乳腺癌腫瘤干細(xì)胞(Breast cancer stem cells, BCSC)具有無限增殖、自我更新和多向分化能力,是乳腺癌無法治愈的根源。由于具有耐藥性,BCSC對(duì)殺傷普通腫瘤細(xì)胞的化療藥物不敏感,單一的療法往往不能達(dá)到理想的治療效果。研究表明,恢復(fù)BCSC中下調(diào)的microRNA-200c (miR-200c)水平,能減少β-微管蛋白Ⅲ (class III beta-tubulin, TUBB3)的表達(dá),從而提高其對(duì)化療藥物紫杉醇(Paclitaxel, PTX)的敏感性。本研究旨在構(gòu)建基于脂質(zhì)納米粒的給藥系統(tǒng),分別遞釋基因miR-200c及PTX。期望達(dá)到克服乳腺癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性,并有效殺滅乳腺癌腫瘤干細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)基因與化藥的聯(lián)合治療作用。在本課題組前期研究中,固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是表面帶負(fù)電荷的納米載體,本研究在脂質(zhì)材料中加入一種陽離子脂質(zhì)-DOTAP,通過溶劑擴(kuò)散法制備SLN。加入DOTAP后,固體脂質(zhì)納米粒荷正電,隨著DOTAP含量增加,SLN粒徑變小。含20 wt% DOTAP的SLN呈類球形,粒徑為28.4±4.2nm,表面電位為18.4±1.3mV。SLN通過靜電作用密接帶負(fù)電的miRNA,形成復(fù)合物SLN/miRNA.當(dāng)SLN與miRNA復(fù)合的質(zhì)量比為90時(shí),復(fù)合物粒徑為36.1±3.0nm,表面電位為14.7±0.9 mV。透射電鏡照片顯示復(fù)合物形態(tài)呈類球形。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),陽離子SLN具有密接、保護(hù)miRNA的能力。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明,SLN/miRNA復(fù)合物構(gòu)成中,載體與基因質(zhì)量比越高,miRNA從復(fù)合物中的釋放速率越慢。基于課題組的前期工作基礎(chǔ),本研究構(gòu)建了含液體油脂成分的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(Nanotractured lipid carriers, NLC).含20wt%油酸的NLC,粒徑為56.1±9.0nm,表面電位為-17.1±0.2 mV。包封化藥紫杉醇后,載紫杉醇脂質(zhì)納米粒(NLC/PTX)粒徑及電位分別為64.5±3.3 nm,-16.4±0.3 mV.當(dāng)紫杉醇的投藥量為5%時(shí),載藥納米粒包封率為73.33±2.03%,載藥量為3.51±0.07%。體外釋放實(shí)驗(yàn)中,NLC/PTX 48 h時(shí)藥物的累計(jì)釋放百分率超過70%。本研究以懸浮球培養(yǎng)法富集的BCSC作為體外細(xì)胞評(píng)價(jià)模型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)SLN/miR-200c復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,24 h后其miR-200c的表達(dá)量比陽性對(duì)照LipofectamineTM2000提高了11.6倍,顯示SLN能有效攜載miR-200c進(jìn)入細(xì)胞球。細(xì)胞球攝取熒光標(biāo)記的FITC-SLN/ miRNA-CY3復(fù)合物后,觀察不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)熒光變化,并進(jìn)行共定位分析,顯示在12h時(shí),大部分的miRNA可從復(fù)合物中釋放。Western blot測(cè)定結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)染SLN/miR-200c至BCSC后,能實(shí)現(xiàn)紫杉醇耐藥相關(guān)蛋白(TUBB3)表達(dá)量的下調(diào)。共聚焦熒光顯微鏡觀察NLC的細(xì)胞球攝取,結(jié)果顯示細(xì)胞球整體熒光強(qiáng)度與孵育時(shí)間成正比,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),靠近球中心細(xì)胞的攝取量增加。采用酸性磷酸酶法(APH assay)測(cè)定細(xì)胞活力,轉(zhuǎn)染劑量下的SLN對(duì)細(xì)胞球基本不呈現(xiàn)毒性,載體NLC的細(xì)胞毒性較小。乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染SLN/miR-200c復(fù)合物后,其對(duì)紫杉醇的敏感性明顯增強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌腫瘤干細(xì)胞 miRNAs PTX SLN NLC 聯(lián)合治療
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一章 固體脂質(zhì)納米粒/miRNA復(fù)合物的制備及理化性質(zhì)研究14-24
• 1.1 試劑與儀器14-15
• 1.1.1 試劑14
• 1.1.2 儀器14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 1.2.1 固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)的制備15
• 1.2.2 SLN的粒徑與表面電位測(cè)定15
• 1.2.3 SLN/microRNA復(fù)合物的制備15
• 1.2.4 復(fù)合物粒徑及表面電位測(cè)定15-16
• 1.2.5 SLN及SLN/miRNA復(fù)合物透射電子顯微鏡觀察16
• 1.2.6 復(fù)合物凝膠阻滯分析16
• 1.2.7 核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)16
• 1.2.8 復(fù)合物體外釋放實(shí)驗(yàn)16-17
• 1.3 結(jié)果與討論17-22
• 1.3.1 SLN粒徑與表面電位17-18
• 1.3.2 SLN/miRNA復(fù)合物的粒徑與表面電位18
• 1.3.3 納米粒形態(tài)學(xué)觀察18-19
• 1.3.4 凝膠阻滯分析19-20
• 1.3.5 核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)20-21
• 1.3.6 復(fù)合物體外釋放實(shí)驗(yàn)21-22
• 1.4 小結(jié)22-24
• 第二章 紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及理化性質(zhì)研究24-32
• 2.1 試劑與儀器24-25
• 2.1.1 試劑24
• 2.1.2 儀器24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 2.2.1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(Nanostructured lipid carriors,NLC)的制備25
• 2.2.2 NLC粒徑與表面電位測(cè)定25
• 2.2.3 NLC透射電子顯微鏡觀察25
• 2.2.4 紫杉醇含量測(cè)定25-26
• 2.2.5 紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載藥量與包封率的測(cè)定26
• 2.2.6 紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外藥物釋放26-27
• 2.2.7 熒光標(biāo)記NLC的細(xì)胞攝取27
• 2.3 結(jié)果與討論27-31
• 2.3.1 NLC粒徑與表面電位27-28
• 2.3.2 納米粒形態(tài)學(xué)觀察28
• 2.3.3 紫杉醇含量測(cè)定28-29
• 2.3.4 紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量與包封率29
• 2.3.5 紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外藥物釋放29-30
• 2.3.6 熒光標(biāo)記NLC的細(xì)胞攝取30-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第三章 固體脂質(zhì)納米粒/miRNA復(fù)合物與紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的聯(lián)合治療32-50
• 3.1 試劑與儀器32-33
• 3.1.1 試劑32-33
• 3.1.2 儀器33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-39
• 3.2.1 懸浮球培養(yǎng)法富集乳腺癌腫瘤干細(xì)胞33
• 3.2.2 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)遞釋33-36
• 3.2.2.1 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞球攝取33-35
• 3.2.2.2 SLN/miRNA復(fù)合物胞內(nèi)釋放35-36
• 3.2.2.3 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞球毒性36
• 3.2.3 SLN/miRNA復(fù)合物對(duì)TUBB3 mRNA表達(dá)量的影響36-37
• 3.2.4 SLN/miRNA復(fù)合物對(duì)TUBB3蛋白表達(dá)量的影響37-38
• 3.2.5 脂質(zhì)納米載體(NLC)的細(xì)胞球毒性及攝取38-39
• 3.2.5.1 NLC的細(xì)胞球毒性38
• 3.2.5.2 NLC的細(xì)胞球攝取38-39
• 3.2.6 SLN/miRNA復(fù)合物與NLC/PTX的聯(lián)合細(xì)胞球毒性試驗(yàn)39
• 3.3 結(jié)果與討論39-49
• 3.3.1 倒置顯微鏡觀察乳腺癌腫瘤干細(xì)胞39-40
• 3.3.2 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)遞釋40-44
• 3.3.2.1 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞球攝取40-41
• 3.3.2.2 SLN/miRNA復(fù)合物胞內(nèi)釋放41-42
• 3.3.2.3 SLN/miRNA復(fù)合物的細(xì)胞球毒性42-44
• 3.3.3 SLN/miRNA復(fù)合物對(duì)TUBB3 mRNA表達(dá)量的影響44-45
• 3.3.4 SLN/miRNA復(fù)合物對(duì)TUBB3蛋白表達(dá)量的影響45
• 3.3.5 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的細(xì)胞球毒性及攝取45-47
• 3.3.5.1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的細(xì)胞球毒性45-46
• 3.3.5.2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的細(xì)胞球攝取46-47
• 3.3.6 SLN/miRNA復(fù)合物與NLC/PTX的聯(lián)合細(xì)胞球毒性試驗(yàn)47-49
• 3.4 小結(jié)49-50
• 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 綜述58-75
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 作者簡(jiǎn)歷75

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