本文關(guān)鍵詞：VEGFR-2細(xì)胞膜色譜法的建立及藥物篩選應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞的生長輸送營養(yǎng),并且也是腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的主要途徑,而腫瘤血管生成又受多種因子影響。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是最重要的血管生成因子,作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原,它直接參與了血管形成這個(gè)過程,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖,促使新生血管生成,同時(shí)還可有效地提高血管的通透性。VEGF這一功能是通過和其特異性受體結(jié)合來發(fā)揮作用的。VEGF受體家族主要包括三個(gè)成員：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、 VEGFR-3(Flt-4),它們都屬于受體酪氨酸激酶(RTK)Ⅲ型超家族。研究表明VEGFR-2(KDR/Flk-1)在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化反應(yīng)中最為重要,是內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要執(zhí)行者,VEGF與KDR結(jié)合使受體二聚體化,進(jìn)一步激發(fā)KDR酪氨酸發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致自身酶活性和下游信號(hào)相關(guān)酶類的激活,從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)。新生血管的形成對(duì)惡性腫瘤的生長是必不可少的因素,因而以KDR為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選成為抗腫瘤血管生成的重要方略。 目前存在的篩選VEGFR-2抑制劑的方法以檢測酶活性為主,但是一些傳統(tǒng)方法如酶譜分析法、免疫分析法、放射性配基法等存在不可避免的缺點(diǎn),不適合大量、多組分化合物的篩選。與此同時(shí),組合化學(xué)技術(shù)大大加快了藥物及其先導(dǎo)化合物的合成速度,所以,建立一個(gè)簡便快速的篩選平臺(tái)勢在必行。 鑒于以上原因,本文建立了VEGFR-2細(xì)胞膜色譜法,并應(yīng)用于一系列VEGFR-2小分子抑制劑的初步藥理活性篩選。 實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)對(duì)比選擇了硅膠、殼聚糖／二氧化硅(CTS/SiO2)、海藻酸鈉／二氧化硅(ALG/SiO2)載體材料制備細(xì)胞膜固定相用于建立VEGFR-2細(xì)胞膜色譜。 本文制備了兩種有機(jī)無機(jī)復(fù)合載體材料分別為CTS/SiO2和ALG/SiO2。首先本工作對(duì)殼聚糖的脫乙酰度和Si02的硅羥基含量進(jìn)行了測定,制備CTS/SiO2復(fù)合材料采用環(huán)氧氯丙烷修飾的Si02顆粒,Si02顆粒表面的硅烷醇羥基基團(tuán)和較大的表面積使其能和環(huán)氧氯丙烷充分反應(yīng),得到功能化的羥丙基氯化的Si02顆粒,再交聯(lián)固定在殼聚糖上形成CTS/SiO2復(fù)合材料,采用L18(37)正交試驗(yàn)考察了制備工藝中的催化劑的量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度,考察指標(biāo)為復(fù)合材料中殼聚糖含量。ALG/SiO2利用海藻酸鈉在二價(jià)鈣離子的存在下可使海藻酸交聯(lián)的特性,將Si02顆粒分散至海藻酸鈉溶液中,并將其滴入CaCl2溶液中形成海藻酸鈣/Si02水凝膠,經(jīng)過固化洗滌后形成ALG/SiO2復(fù)合材料,實(shí)驗(yàn)中考察了海藻酸鈉和Si02加入的比例以及CaCl2溶液的濃度。并利用掃描電子顯微鏡、紅外光譜、熱重分析、元素分析等對(duì)兩種雜化材料進(jìn)行表征,采用固定化明膠酶的方法考察不同載體的生物相容性,并計(jì)算酶的特征參數(shù)——Km。 本工作第二項(xiàng)重要內(nèi)容是高表達(dá)VEGFR-2細(xì)胞的篩選與細(xì)胞膜制備,通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)待篩的幾種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面VEGFR-2抗原測定,選出高表達(dá)VEGFR-2受體的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,并通過差速離心獲取活性和純度較好的細(xì)胞膜,考察了細(xì)胞膜獲取的破碎方式、離心速度、溫度對(duì)細(xì)胞膜蛋白和活性的影響。然后將細(xì)胞膜吸附融合在載體材料表面,制成細(xì)胞膜固定相,考察了細(xì)胞膜和載體的配比等因素,確定最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案,并考察不同載體對(duì)固載細(xì)胞膜蛋白的量和ATP酶活性的影響。 篩選抑制劑：以上市藥物sunitinib為陽性對(duì)照,用以上建立的方法測定其在VEGFR-2細(xì)胞膜色譜柱上的保留,驗(yàn)證模型的可靠性,并考察精密度。分別進(jìn)樣新合成的10種鄰氨基苯甲酰胺類的VEGFR-2小分子抑制劑,考察各化合物在柱上的保留時(shí)間和容量因子,將兩種不同的色譜固定相的篩選結(jié)果進(jìn)行對(duì)照,并與MTT法篩藥結(jié)果進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CTS/SiO2的最佳反應(yīng)條件為：70℃反應(yīng)4h,催化劑為0.10g；掃描電鏡結(jié)果分析為殼聚糖交聯(lián)的團(tuán)狀Si02顆粒；紅外光譜可明顯看出殼聚糖和Si02的特征峰；熱重分析表明,雜化材料的熱性能略有降低,與物理混合物有明顯區(qū)別；元素分析可明顯看出雜化材料中殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.3%、ALG/SiO2雜化材料制備工藝中海藻酸鈉和Si02的最優(yōu)比例為1：2,CaCl2溶液的最佳濃度為1.0mol/L;掃描電鏡分析其形態(tài)為不規(guī)則形Si02包埋穿梭與海藻酸鈣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中；紅外光譜也可看出海藻酸鈉和Si02的特征峰；熱重分析表明雜化材料的熱性能提高了；元素分析可明顯看出雜化材料中海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.9%。兩種材料對(duì)明膠酶的鍵合量和Km與硅膠相比,硅膠固載酶量為4848±80U/g,Km為0.33±0.0015,CTS/SiO2固載酶量為5094±59U/g,Km為0.075±0.00018,ALG/SiO2固載酶量為5388±21U/g,Km為0.035±0.00019。 流式細(xì)胞儀篩選的VEGFR-2表達(dá)量最高的腫瘤細(xì)胞是U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,在4℃條件下,采用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞,先低速離心(600g)10min,再高速離心(14000g)25min收集細(xì)胞膜,細(xì)胞膜與載體的最佳比例為2×106/0.01g。 細(xì)胞膜色譜法測定的陽性藥sunitinib的保留時(shí)間最長,且穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好,MTT法也可證實(shí)其IC50為760nM,表明篩選模型是可行的。對(duì)另外10個(gè)化合物,三種細(xì)胞膜色譜法和MTT比色法測定結(jié)果整體趨勢保持一致,其與細(xì)胞膜結(jié)合的活性均較陽性藥差別較大,但總體上藥物在硅膠細(xì)胞膜色譜上的保留時(shí)間略微偏長,CTS/SiO2細(xì)胞膜色譜法篩選效果最好。 結(jié)論：本文分別選用SiO2、CTS/SiO2、ALG/SiO2細(xì)胞膜固定相建立VEGFR-2細(xì)胞膜色譜的篩選方法是可行的,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大量多組分化合物快速篩選。
【關(guān)鍵詞】：血管內(nèi)皮生長因子受體 硅膠 殼聚糖 海藻酸鈉 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 細(xì)胞膜色譜 VEGFR-2抑制劑 藥物篩選
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要12-15
• ABSTRACT15-19
• 符號(hào)說明19-21
• 前言21-35
• 1 血管內(nèi)皮生長因子受體21-23
• 1.1 VEGF的分類、調(diào)節(jié)與功能21-23
• 1.2 以VEGFR-2為駛點(diǎn)的酪l#酸激酶抑制劑23
• 2 藥物蹄選模型23-24
• 3 生物色譜法24-25
• 4 細(xì)胞膜色譜法25-27
• 4.1 細(xì)胞膜與藥物的相互作用25
• 4.2 細(xì)胞膜色譜法的提出25-26
• 4.3 細(xì)胞膜色譜法的技術(shù)特點(diǎn)26-27
• 5 生物載體材料27-29
• 5.1 有機(jī)高分子載體材料28
• 5.2 無機(jī)載體材料28
• 5.3 復(fù)合載體材料28-29
• 6 本論文選題的目的與研究內(nèi)容29-31
• 7 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)31
• 參考文獻(xiàn)31-35
• 第一章 兩種復(fù)合材料的制備35-55
• 1 儀器與試劑37-38
• 1.1 儀器37
• 1.2 材料37-38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 2.1 CTS/SiO_2雜化材料的制備及性能研究38-40
• 2.1.1 殼聚糖脫乙酰度的測定38
• 2.1.2 SiO_2的硅羥基含量測定38
• 2.1.3 CTS/SiO_2雜化材料的制備方法38-39
• 2.1.4 CTS/SiO_2雜化材料的表征39-40
• 2.2 ALG/SiO_2雜化材料的制備及性能40-41
• 2.2.1 海藻酸鈉與SiO_2的制備比例考察40
• 2.2.2 CaCl_2濃度對(duì)ALG/SiO_2復(fù)合材料質(zhì)量溶脹率的影響40
• 2.2.3 ALG/SiO_2雜化材料的表征40-41
• 2.3 兩種雜化材料的性能考察41-42
• 2.3.1 固定化明膠酶鍵合率41
• 2.3.2 最佳活性條件下測定求固定化明膠酶K_m41-42
• 3 結(jié)果與討論42-53
• 3.1 CTS/SiO_2雜化材料的制備及性能研究42-49
• 3.1.1 殼聚糖脫乙酰度的測定42-43
• 3.1.2 SiO_2的硅羥基含量測定43
• 3.1.3 CTS/SiO_2雜化材料的制備方法43-45
• 3.1.4 CTS/SiO_2雜化材料的表征45-49
• 3.2 ALG/SiO_2雜化材料的制備及性能49-51
• 3.2.1 海藻酸鈉與SiO_2的制備比例考察49
• 3.2.2 CaCl_2濃度對(duì)ALG/SiO_2復(fù)合材料溶脹率的影響49
• 3.2.3 ALG/SiO_2雜化材料的表征49-51
• 3.3 兩種雜化材料的性能考察51-53
• 3.3.1 固定化明膠酶鍵合率52
• 3.3.2 最佳活性條件下測定求固定化明膠酶K_m52-53
• 4 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-55
• 第二章 高表達(dá)VEGFR-2細(xì)胞的篩選及細(xì)胞膜制備55-67
• 1 儀器與材料56-57
• 1.1 儀器56
• 1.2 材料56-57
• 2 實(shí)驗(yàn)方法57-62
• 2.1 實(shí)驗(yàn)溶液的配制57-58
• 2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)58-59
• 2.3 高表達(dá)VEGFR-2細(xì)胞的篩選59-60
• 2.4 U251細(xì)胞膜的制備條件的考察60-62
• 2.4.1 細(xì)胞膜的分離提取60-61
• 2.4.2 破碎方法的考察61-62
• 2.4.3 離心力的選擇62
• 3 結(jié)果與討論62-65
• 3.1 高表達(dá)VEGFR-2細(xì)胞的篩選62-64
• 3.2 U251細(xì)胞膜的制備條件的考察結(jié)果64-65
• 3.2.1 細(xì)胞破碎的方法的選擇64-65
• 3.2.2 離心力的選擇65
• 4 小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-67
• 第三章 CMSP的制備及篩選模型的建立和應(yīng)用67-86
• 1 儀器和材料70-71
• 1.1 儀器70
• 1.2 材料70-71
• 2 實(shí)驗(yàn)方法71-74
• 2.1 CMSP的制備71
• 2.2 CMSP中載體與細(xì)胞數(shù)的比例71
• 2.3 CMSP的掃描電鏡及表面能譜分析71
• 2.4 細(xì)胞膜色譜柱的填裝71-72
• 2.5 模型的建立72-73
• 2.5.1 色譜條件72
• 2.5.2 溶液配制72
• 2.5.3 紫外光譜測定化合物吸收度72
• 2.5.4 流動(dòng)相條件的考察72-73
• 2.6 模型評(píng)價(jià)73
• 2.6.1 CMC系統(tǒng)的有效使用期限73
• 2.6.2 CMC系統(tǒng)的穩(wěn)定性73
• 2.6.3 CMC系統(tǒng)的專屬性73
• 2.7 鄰氨基苯甲酰胺類VEGFR-2小分子抑制劑的篩選73
• 2.8 對(duì)照實(shí)驗(yàn)73-74
• 3 結(jié)果與討論74-84
• 3.1 載體與細(xì)胞數(shù)的比例74-75
• 3.2 CMSP的掃描電鏡圖片及表面能譜分析75-76
• 3.3 模型的建立76-78
• 3.3.1 模型藥物的選擇76-77
• 3.3.2 紫外分光光度法測定化合物吸收度77
• 3.3.3 流動(dòng)相條件的考察77-78
• 3.4 模型的評(píng)價(jià)78-80
• 3.4.1 CMC系統(tǒng)的專屬性78-79
• 3.4.2 CMC系統(tǒng)中CMSP隨溫度和時(shí)間的變化規(guī)律79
• 3.4.3 CMC系統(tǒng)的穩(wěn)定性79
• 3.4.4 CMC系統(tǒng)精密度考察79-80
• 3.5 鄰氨基苯甲酰胺類VEGFR-2小分子抑制劑的篩選80-82
• 3.6 對(duì)照實(shí)驗(yàn)82-84
• 4 小結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-86
• 全文總結(jié)86-88
• 展望88-89
• 附錄89-103
• 致謝103-104
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文104-105
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表105

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：VEGFR-2細(xì)胞膜色譜法的建立及藥物篩選應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：357435