本文關鍵詞：Mcl-1在3-溴丙酮酸誘導乳腺癌細胞凋亡敏感性中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.探究3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-Br PA)對人乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響。2.研究3-Br PA誘導乳腺癌細胞凋亡對Caspase的依賴性。3.探討ROS在3-BrPA誘導乳腺癌細胞產(chǎn)生凋亡中的作用。4.探討PI3K/Akt通路在3-Br PA誘導乳腺癌細胞凋亡過程中的作用。5.探討Mcl-1在乳腺癌細胞對3-Br PA誘導凋亡敏感性中的作用。方法:1.MTT法檢測3-Br PA處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435后對細胞存活率的影響。2.溴化丙啶(propidium iodide,PI)單染法及Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測藥物處理乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h后對細胞存活率的影響。3.DHE檢測試劑盒檢測3-Br PA(160?mol·L-1)處理人乳腺癌細胞MDA-MB-2311 h、3 h及6 h后細胞內超氧陰離子水平。4.ATP檢測試劑盒檢測不同濃度3-Br PA(40,80,160?mol·L-1)處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 6 h后細胞內ATP水平。5.Western blot法檢測3-Br PA處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231對凋亡相關蛋白Mcl-1表達及PI3K/Akt信號通路的影響。6.利用si RNA技術下調Mcl-1觀察MDA-MB-435細胞對3-Br PA誘導其凋亡敏感性的變化。7.利用過表達技術上調Mcl-1觀察MDA-MB-231細胞對3-Br PA誘導其凋亡敏感性的變化。結果:1.不同濃度3-Br PA對人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖及凋亡的影響1.1使用不同濃度3-Br PA(10,20,40,80,160?mol·L-1)分別處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h,48 h及72 h,MTT法檢測細胞存活率,實驗結果顯示,3-Br PA對乳腺癌細胞MDA-MB-231有增殖抑制作用,且隨著濃度的增加和作用時間的延長,3-Br PA對乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制作用也不斷增強,而MDA-MB-435細胞在此濃度范圍未發(fā)現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象。1.2 3-Br PA(40,80,160?mol·L-1)分別處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h,PI單染法檢測結果顯示:隨著3-Br PA濃度的增加,MDA-MB-231細胞的凋亡率逐漸增多,而MDA-MB-435細胞的凋亡率無明顯變化。Annexin V-FITC/PI雙染法進一步驗證MDA-MB-231凋亡情況,結果與單染法所得結果一致。2.3-Br PA誘導乳腺癌細胞MDA-MB-231發(fā)生凋亡是非caspase依賴的2.1使用160??mol·L-1 3-Br PA分別處理MDA-MB-231細胞6 h,16 h及24 h,Western blot結果顯示:與對照組相比,16 h組和24 h組有一定的Caspase-8和Caspase-3的激活。2.2使用160??mol·L-1 3-Br PA分別處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231 1 h,3 h及6 h,DHE檢測結果顯示:隨著時間的延長,MDA-MB-231細胞內活性氧逐漸增多。2.3 ATP實驗結果顯示,3-BrPA(40,80,160??mol·L-1)對兩株乳腺癌細胞內的ATP生成均起到抑制作用,且呈濃度依賴性。2.4為了進一步確認3-Br PA誘導乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡是否為caspase依賴,我們使用160?mol·L-1 3-Br PA和Caspase抑制劑z-VAD-fmk(20?mol·L-1)聯(lián)合處理MDA-MB-231細胞,結果顯示,z-VAD-fmk對發(fā)生凋亡的MDA-MB-231細胞不具有保護作用。3.3-Br PA通過PI3K/Akt信號通路調節(jié)Mcl-1的表達3.1使用160?mol·L-1 3-Br PA分別處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435 6 h,16 h及24 h,Western blot結果顯示:在MDA-MB-231細胞中,24 h組Mcl-1及p-Akt的表達量較對照組,16 h組及6 h組明顯降低;而在MDA-MB-435細胞中,6 h組、16 h組級24 h組較對照組有所上升。3.2使用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002(10?mol·L-1)分別處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231 6 h、16 h及24 h后,Western bolt檢測結果顯示24 h組Mcl-1的表達量較對照組,16 h組及6 h組明顯降低。實驗結果顯示:3-Br PA誘導MDA-MB-231細胞產(chǎn)生的凋亡可能是通過PI3K/Akt通路下調凋亡相關蛋白Mcl-1引起的。4.下調Mcl-1表達可增強MDA-MB-435細胞對3-Br PA誘導凋亡的敏感性4.1用Mcl-1 si RNA預處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231,24 h后,Western bolt檢測Mcl-1表達量明顯降低。沉默Mcl-1的表達后,用160?mol·L-1 3-Br PA處理MDA-MB-231細胞24 h,使用MTT法檢測其存活率,并與對照組相比較。實驗結果顯示:與對照組相比,Mcl-1 si RNA預處理后,3-Br PA誘導MDA-MB-435細胞發(fā)生凋亡在一定程度被增強了。4.2 Western blot結果顯示:沉默Mcl-1的表達后,使用160?mol·L-1 3-Br PA處理MDA-MB-435細胞24 h,與對照組相比,處理組有一定的Caspase-3的激活。5.上調Mcl-1表達可降低MDA-MB-231細胞對3-Br PA誘導凋亡的敏感性5.1用Mcl-1 c DNA預處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231,24 h后,Western bolt檢測Mcl-1表達量明顯升高。過表達Mcl-1后,用160?mol·L-1 3-Br PA處理MDA-MB-231細胞24 h,使用MTT法檢測其存活率,并與對照組相比較。實驗結果顯示:與對照組相比,Mcl-1 c DNA預處理后,3-Br PA誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡一定程度被抑制。5.2 Western blot結果顯示:過表達Mcl-1后,使用160?mol·L-1 3-Br PA處理MDA-MB-231細胞24 h,處理組Caspase-3未發(fā)現(xiàn)激活,細胞受到保護。結論:1.3-Br PA可以誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡。2.3-Br PA誘導乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的過程中伴隨著活性氧的升高。3.調節(jié)Mcl-1的表達可能是3-Br PA誘導乳腺癌細胞凋亡的機制之一。
【關鍵詞】：乳腺癌 3-溴丙酮酸 氟甲基酮 凋亡 髓細胞白血病-1 活性氧
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-28
• 1.材料與儀器15-17
• 2.實驗方法17-27
• 2.1 細胞培養(yǎng)17
• 2.2 MTT法檢測細胞存活率17-18
• 2.3 DHE 熒光探針檢測藥物對細胞 ROS 的影響18-19
• 2.4 PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡19-20
• 2.5 Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡20-21
• 2.6 ATP檢測試劑盒檢測細胞內ATP水平變化21-22
• 2.7 免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達22-26
• 2.8 siRNA 下調乳腺癌細胞凋亡相關蛋白的表達26-27
• 2.9 cDNA 上調乳腺癌細胞凋亡相關蛋白的表達27
• 3. 統(tǒng)計學處理27-28
• 結果28-38
• 1. 不同濃度 3-Br PA 對乳腺癌 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435 細胞增殖和凋亡的影響28-29
• 2. 3-BrPA誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡是非caspase依賴的29-32
• 3. 3-BrPA通過PI3K/AKT通路下調乳腺癌MDA-MB-231細胞Mcl-1 的表達32-34
• 4. 下調 Mcl-1 表達可增強 MDA-MB-435 細胞對 3-Br PA 誘導凋亡的敏感性34-36
• 5. 上調 Mcl-1 表達可降低 MDA-MB-231 細胞對 3-Br PA 誘導凋亡的敏感性36-38
• 討論38-42
• 結論42-43
• 參考文獻43-46
• 致謝46-47
• 附錄A：英中文術語縮略詞表47-49
• 附錄B：常用試劑配制49-53
• 附錄C：在校期間發(fā)表的文章53-54
• 附錄D：綜述 3-溴丙酮酸抗腫瘤機制的研究54-60
• 參考文獻58-60

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1 毛玉昌,章平,徐洪鈞,徐峰,賈彩鳳,錢e，

本文編號：357209