本文關(guān)鍵詞：α-倒捻子素衍生物對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:在傳統(tǒng)觀念中,成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是不可再生的,一旦出現(xiàn)神經(jīng)元的損傷或者丟失將難以修復(fù),也就是說幾乎不可能重建神經(jīng)功能。直到上個世紀(jì)90年代,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)徹底改變了損傷神經(jīng)元不可修復(fù)的傳統(tǒng)觀念。另外,通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn),各種腦損傷如腦部缺血、腦部創(chuàng)傷和癲癇等都會產(chǎn)生大量可溶性細(xì)胞損傷信號,這一信號激活了神經(jīng)干細(xì)胞的新生,選擇性地補(bǔ)充了大腦皮層丟失的神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元,為這一類疾病的治療帶來希望。因此,有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞的的增殖及其分化的調(diào)控機(jī)制隨即成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。α-倒捻子素(α-Mangostin)是從山竹的果皮中分離提取得到的一類酮類化合物,它具有廣泛的生物學(xué)、藥理學(xué)活性。并且,α-Mangostin的母核結(jié)構(gòu)與他克林相似,故可推斷其衍生物對神經(jīng)干細(xì)胞分化也有一定影響。通過前期的探索實驗,發(fā)現(xiàn)α-Mangostin的一些衍生物可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化,如果能促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元,則對臨床用藥具有重大意義。目的:本研究通過原代培養(yǎng)分離獲得神經(jīng)干細(xì)胞,并探尋最適合的培養(yǎng)條件。在加入一系列α-倒捻子素衍生物后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測其分化為神經(jīng)元的比例。同時利用蛋白印跡法(western blot)探究其分化的機(jī)制。方法:本研究內(nèi)容分為三個部分:(1)建立原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法,分別以1×105個/ml,1×106個/ml,1×107個/ml的密度接種神經(jīng)干細(xì)胞,通過比較找到合適的接種密度。再以機(jī)械傳代和胰酶傳代兩種方式進(jìn)行傳代,比較神經(jīng)干細(xì)胞后期生長情況以確定合適的傳代方式。在神經(jīng)干細(xì)胞分化后利用免疫熒光法鑒定相應(yīng)的細(xì)胞。(2)設(shè)立三個組:陰性對照組(不加抗體處理),不加藥組(只加1%胎牛血清),以及加入α-倒捻子素衍生物(100ng/ml)的實驗組。分化7天后加入NSE(1:100)抗體進(jìn)特異性染色,利用流式細(xì)胞儀檢測其分化為神經(jīng)元的比例。(3)選擇前期實驗分化效果最好的一個α-倒捻子素衍生物干預(yù)神經(jīng)干細(xì)胞分化,利用蛋白印跡法(western blot)檢測干預(yù)0,3,5,7,9天后的Axin,β-catenin,Wnt-1,Cyclin D1和Notch-1的蛋白表達(dá)。初步探究神經(jīng)干細(xì)胞分化的機(jī)制。結(jié)果:(1)1×105個/ml接種的神經(jīng)干細(xì)胞大多增殖克隆形成較小團(tuán)狀,只有少數(shù)形成小型神經(jīng)球。1×106個/ml接種的神經(jīng)干細(xì)胞能很好地形成大小合適的神經(jīng)球。1×107個/ml接種的神經(jīng)干細(xì)胞由于細(xì)胞過于密集,形成的神經(jīng)球過大,神經(jīng)球中心細(xì)胞死亡,且容易貼壁分化。另外,胰酶傳代的方式相對機(jī)械傳代,對細(xì)胞損傷更小,第二代神經(jīng)干細(xì)胞狀態(tài)更好。(2)在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果中,與陰性對照組相比,不加藥組和實驗組的信號都發(fā)生右移。各α-倒捻子素衍生物對神經(jīng)干細(xì)胞的分化均有一定影響,其中以A-GM2在100ng/ml濃度下提高比例最大,由不加藥分化的22%提高到約37%,效果顯著。(3)通過WB發(fā)現(xiàn)Wnt-1在分化前期大量增加,后期減少。Axin在整個分化過程中逐漸減少,在未分化的神經(jīng)干細(xì)胞中含量最高。Axin的減少抑制了β-catenin磷酸化降解,使β-catenin在整個分化過程中含量逐漸增加。β-catenin的增加激活了Wnt信號相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄,其下游蛋白Cyclin D1表達(dá)增加,同時抑制了Notch-1的表達(dá)。結(jié)論:(1)1×106個/ml的接種密度以及胰酶傳代的方法為最合適的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)條件。(2)α-倒捻子素衍生物有調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化的功能,對神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元有不同程度的調(diào)控作用。(3)Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路中,通過高表達(dá)的Wnt-1與其他蛋白的結(jié)合激活了散亂蛋白Dvl,Dvl在細(xì)胞內(nèi)拮抗由蛋白CKI,GSK-3β,Axin和APC所組成的β-catenin降解復(fù)合物的活性。導(dǎo)致β-catenin不能通過磷酸化降解。β-catenin的增加激發(fā)了Wnt-1相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄,其下游蛋白Cyclin D1表達(dá)逐漸增加,從而促進(jìn)細(xì)胞分化。在整個分化過程中Wnt/β-catenin通路與Notch信號通路相互作用,且Notch-1起負(fù)調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：α-倒捻子素衍生物 神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)元 Wnt/β-catenin Notch-1
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 縮略詞表14-16
• 第一章 緒論16-26
• 1.1 國內(nèi)外關(guān)于本課題的研究進(jìn)展16-19
• 1.1.1 α-倒捻子素研究進(jìn)展16-18
• 1.1.2 神經(jīng)干細(xì)胞及其分化研究進(jìn)展18-19
• 1.2 Nestin,NSE,GFAP與神經(jīng)干細(xì)胞的分化19
• 1.3 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞檢測中的應(yīng)用19-20
• 1.4 Wnt/β-catenin信號通路20-21
• 1.5 Notch信號通路21-22
• 1.6 α-倒捻子素衍生物的合成方法22-24
• 1.7 本課題選題及研究意義24-26
• 第二章 神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 實驗材料及方法26-30
• 2.2.1 藥品試劑及儀器26-27
• 2.2.2 溶液的制備27
• 2.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)27-28
• 2.2.4 細(xì)胞接種密度探究方法28-29
• 2.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞傳代方法29
• 2.2.6 免疫熒光法29-30
• 2.3 實驗結(jié)果30-35
• 2.3.1 原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)30-31
• 2.3.2 不同接種密度對神經(jīng)干細(xì)胞生長的影響31-33
• 2.3.3 不同傳代方式對神經(jīng)干細(xì)胞生長的影響33-34
• 2.3.4 免疫熒光鑒定結(jié)果34-35
• 2.3.5 神經(jīng)干細(xì)胞凍存結(jié)果35
• 2.4 討論35-37
• 第三章 α-倒捻子素衍生物對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響37-46
• 3.1 引言37
• 3.2 實驗材料及方法37-40
• 3.2.1 藥品試劑及儀器37-38
• 3.2.2 主要溶液配制38
• 3.2.3 不同血清濃度對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響38
• 3.2.4 機(jī)械吹打?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞分化的影響38-39
• 3.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化實驗39
• 3.2.6 神經(jīng)元細(xì)胞鑒定39
• 3.2.7 流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元比例39-40
• 3.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計40
• 3.3 實驗結(jié)果40-44
• 3.3.1 不同濃度的血清對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響40-41
• 3.3.2 機(jī)械吹打?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞分化的影響41-42
• 3.3.3 流式細(xì)胞實驗結(jié)果42-44
• 3.3.4 免疫熒光結(jié)果44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 神經(jīng)干細(xì)胞分化機(jī)制的研究46-55
• 4.1 引言46
• 4.2 材料和方法46-51
• 4.2.1 實驗藥品和儀器46-47
• 4.2.2 溶液配制47-48
• 4.2.3 蛋白質(zhì)提取48-49
• 4.2.4 蛋白印跡法49-50
• 4.2.5 制膠方法50-51
• 4.3 實驗結(jié)果51-53
• 4.3.1 Notch-1 蛋白表達(dá)結(jié)果51
• 4.3.2 β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果51
• 4.3.3 Wnt-1 蛋白表達(dá)結(jié)果51-52
• 4.3.4 Axin蛋白表達(dá)結(jié)果52
• 4.3.5 Cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果52-53
• 4.4 討論53-55
• 總結(jié)與展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 碩士期間已發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62

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本文編號：354883