本文關(guān)鍵詞：D-對羥基苯甘氨酸生物合成酶的優(yōu)化及固定化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1對海洋沉積物進(jìn)行系列性篩選,以獲得全新來源并具有潛在高性能的海因酶,并提供一種全新的海因酶陽性菌篩選體系和一種全新的酶優(yōu)化手段。2構(gòu)建快速篩選模型,篩選性能更優(yōu)的海因酶突變體,并為同類酶的優(yōu)化提供依據(jù)。3對海因酶工程菌進(jìn)行固定化研究,獲得全細(xì)胞固定海因酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)配方,為D-對羥基苯甘氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。方法1以實(shí)驗(yàn)室保存的鏈霉菌庫為篩選對象,利用唯一氮源法、雙層瓊脂法、微孔快速篩選法和分子生物學(xué)篩選法對其進(jìn)行系列性篩選,獲得可表達(dá)海因酶的陽性鏈霉菌;從篩選獲得陽性菌中擴(kuò)增目的片段,分析基因序列并進(jìn)行工程菌構(gòu)建;測定海因酶的酶活和動力學(xué)參數(shù);利用Swiss-model在線軟件對海因酶進(jìn)行在線同源建模和Caver Analyst軟件對其的催化通道進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬分析;2利用易錯(cuò)PCR構(gòu)建海因酶突變庫;構(gòu)建快速篩選模型進(jìn)行突變酶篩選;對突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定;3利用海藻酸鈉作為固定載體,對海因酶工程菌進(jìn)行全細(xì)胞固定化研究;優(yōu)化海藻酸鈉濃度、硅藻土濃度、戊二醛濃度、Ca Cl2濃度和Mn Cl2濃度;測定固定化小球的最適直徑和最適添加濃度;測定固定化全細(xì)胞小球的批次實(shí)驗(yàn)次數(shù);測定固定化全細(xì)胞小球的機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)果1篩選獲得四株陽性菌,分別命名為S1、S14、S29和S145菌株,隨后對不同菌株來源的海因酶的酶動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,S145菌株來源的海因酶活性最高,為9.7 U/mg,催化動力學(xué)常數(shù)Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mmol/L;海因酶結(jié)構(gòu)的同源模建和催化通道模擬分析,結(jié)果顯示其主要催化通道Tunnel_1長度為9.1?,瓶頸氨基酸殘基為50位的組氨酸、181位的組氨酸和313位的谷氨酸,瓶頸半徑為2.18?;潛在催化通道Tunnel_2長度為13.6?,瓶頸氨基酸為62位的蘇氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶頸半徑為1.52?;2篩選出七株陽性突變菌,突變位點(diǎn)主要集中在181位和286位;181位突變菌的酶活為11.5 U/mg,對產(chǎn)物的耐受力提高10%;286位突變菌的酶活為11.0 U/mg,對底物的耐受力提高11%;3獲得固定化細(xì)胞的最優(yōu)配方為:3.0%海藻酸鈉、1.5%硅藻土、0.05%Ca Cl2和1.0 m M Mn Cl2;固定化小球最適直徑位2.6 mm,所占濃度最適為20%;固定化全細(xì)胞小球可重復(fù)使用12批次,其催化生產(chǎn)產(chǎn)物的產(chǎn)率為88%以上。結(jié)論1開發(fā)了一種海因酶系列篩選策略,獲得潛在的酶優(yōu)化位點(diǎn),為后期酶的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ);2篩選獲得了性能更優(yōu)的突變海因酶;3制備了高性能固定化細(xì)胞的固定化配方,從而為酶法工業(yè)生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸成為可能。
【關(guān)鍵詞】：D-海因酶 D-對羥基苯甘氨酸 D-苯海因 海洋鏈霉菌 CaverAnalyst 定向進(jìn)化 海藻酸鈉 全細(xì)胞固定
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-44
• 1.1 材料與方法13-27
• 1.1.1 材料13-18
• 1.1.2 方法18-27
• 1.2 結(jié)果27-38
• 1.2.1 菌種的分離、純化和鑒定27-28
• 1.2.2 海因酶工程菌構(gòu)建28-29
• 1.2.3 海因酶的表達(dá)與動力學(xué)參數(shù)測定29-30
• 1.2.4 基于 16S rRNA的同源分析30
• 1.2.5 海因酶催化通道的分子模擬分析30-31
• 1.2.6 海因酶突變庫的構(gòu)建及篩選31-32
• 1.2.7 突變酶活力的測定32
• 1.2.8 海因酶的酶學(xué)性質(zhì)測定32-34
• 1.2.9 固定化全細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù)優(yōu)化34-38
• 1.2.10 固定化全細(xì)胞小球批次實(shí)驗(yàn)測定38
• 1.3 討論38-40
• 1.4 結(jié)論40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第2章 綜述44-59
• 2.1 海因酶產(chǎn)生菌的篩選方法45-47
• 2.1.1 唯一氮源法45
• 2.1.2 雙層瓊脂法45-46
• 2.1.3 微孔快速篩選法46
• 2.1.4 分子生物學(xué)篩選法46-47
• 2.2 海因酶的定向進(jìn)化47-50
• 2.2.1 易錯(cuò)PCR47-48
• 2.2.2 DNA shuffling48-49
• 2.2.3 隨機(jī)引物體外重組法49-50
• 2.3 酶的固定化研究50-52
• 2.3.1 酶的固定化技術(shù)50-51
• 2.3.2 細(xì)胞的固定化技術(shù)51-52
• 2.4 結(jié)論和展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 導(dǎo)師簡介61-63
• 作者簡介63-66
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李亞東;汪康游;樊帥;楊兆勇;田喜鳳;許樂幸;金媛媛;;海洋來源的D-海因酶產(chǎn)生菌的分離及酶催化通道模擬分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2016年05期

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5 王培;曹建華;宋德貴;辜瀾濤;董研玲;;一株產(chǎn)海因酶菌種的篩選與鑒定[J];廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年01期

6 張佳寧;宋云花;王s，

本文編號：346733