發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 23:14

  本文關(guān)鍵詞：靶向性p53融合蛋白的制備、檢測(cè)與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物藥物是一類采用現(xiàn)代生物技術(shù)而得到的用于預(yù)防、治療和診斷的藥物。因其具有藥理活性高、毒副作用小、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、治療針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)而成為21世紀(jì)最有發(fā)展?jié)摿Φ男屡d藥物。因此國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域高度重視生物藥物的研發(fā)和制備,而對(duì)其分析鑒定和檢測(cè)則是將其推廣至臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因,它編碼的p53蛋白在識(shí)別和修復(fù)DNA損傷、抑制細(xì)胞惡性增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯方面發(fā)揮重要作用。野生型p53基因的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,然后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)功能的紊亂。據(jù)報(bào)道稱,25%-35%的癌性神經(jīng)細(xì)胞和70%-76%的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變,所以恢復(fù)細(xì)胞中的p53蛋白功能被認(rèn)為是神經(jīng)腫瘤治療的一種方法。由于p53蛋白的制備、檢測(cè)及功能分析是其用于腫瘤治療的基礎(chǔ),常規(guī)的檢測(cè)方法如ELISA、Western blot等只能對(duì)p53蛋白進(jìn)行定性和定量分析,不能保證其生物活性,因此需要既能保證蛋白準(zhǔn)確性又能檢測(cè)其功能的方法來(lái)分析檢測(cè)p53。p53蛋白細(xì)胞滲透性較低,僅靠自身難以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入神經(jīng)腫瘤細(xì)胞,這使得p53蛋白的應(yīng)用受到了一定限制。因此可考慮p53蛋白與具有穿膜效應(yīng)的多肽結(jié)合來(lái)提高p53蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。我們實(shí)驗(yàn)組前期發(fā)現(xiàn)一個(gè)新型衍生肽,命名為RDP (RVG-derived peptides),它的部分序列來(lái)源于狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)嗜神經(jīng)性的關(guān)鍵片段。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能攜帶BDNF蛋白及基因快速特異性地進(jìn)入腦內(nèi)并發(fā)揮功能,因此考慮將RDP與p53蛋白通過(guò)化學(xué)鍵連接,確定其分析方法并檢測(cè)p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能,從而希望為抑制神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,如惡性腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)增殖提供一種新的方法。本文主要分三個(gè)部分進(jìn)行,第一部分：利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-p53,將p53基因連接至pET28a中。優(yōu)化了p53蛋白的制備條件,SDS-PAGE分析了p53蛋白的準(zhǔn)確性,Folin-酚法對(duì)p53蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定,然后分別制備并純化了靶向性p53融合蛋白和p53蛋白。第二部分：分別合成了熒光染料FITC和羅丹明B異硫氰酸酯(RhoB)標(biāo)記的靶向性p53融合蛋白和p53蛋白,并采用熒光分光光度法分析了該蛋白的熒光強(qiáng)度,然后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小動(dòng)物活體成像分析檢測(cè)了靶向性p53蛋白的細(xì)胞選擇性和入腦可行性。第三部分：對(duì)靶向性p53融合蛋白的功能進(jìn)行分析。通過(guò)MTT法檢測(cè)靶向性p53融合蛋白的生物活性,并采用凋亡與壞死檢測(cè)、流式細(xì)胞儀來(lái)探究靶向性p53融合蛋白的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靶向性p53融合蛋白不僅對(duì)神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的選擇性更高,而且具有生物活性。這說(shuō)明通過(guò)生物技術(shù)制備的靶向性p53融合蛋白既不會(huì)干擾RDP的生物功能也不會(huì)損害p53蛋白的活性,這可能為抑制神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖提供了一種簡(jiǎn)單有效的新方式。
【關(guān)鍵詞】：生物藥物分析 靶向性p53 制備條件優(yōu)化 細(xì)胞選擇性 活性分析
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R943;R917
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-17
• 1.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤9-12
• 1.2 p53的抗腫瘤作用及其檢測(cè)方法12-15
• 1.3 細(xì)胞穿膜肽概述15-17
• 第二章 緒論17-19
• 第三章 p53蛋白的制備及含量分析19-37
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 3.1.1 菌種與載體19
• 3.1.2 主要試劑和儀器19-20
• 3.1.3 主要試劑的配制20-21
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 3.2.1 載體構(gòu)建21-27
• 3.2.2 制備條件的優(yōu)化、純化、SDS-PAGE及蛋白含量檢測(cè)27-29
• 3.3 結(jié)果29-35
• 3.3.1 基因產(chǎn)物的分析與鑒定29
• 3.3.3 基因測(cè)序分析29-32
• 3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制32
• 3.3.5 SDS-PAGE32-35
• 3.4 結(jié)論與分析35-37
• 第四章 靶向性p53融合蛋白的細(xì)胞特異性鑒定37-45
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 4.1.1 細(xì)胞株37
• 4.1.2 主要試劑和儀器37-38
• 4.1.3 主要試劑的配制38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法38-39
• 4.2.1 FITC和羅丹明B異硫氰酸酯熒光標(biāo)記蛋白的合成38
• 4.2.2 SH-SY5Y和HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng)38-39
• 4.2.3 靶向性p53融合蛋白的細(xì)胞選擇性分析39
• 4.2.4 靶向性p53融合蛋白的活體成像檢測(cè)39
• 4.3 結(jié)果39-42
• 4.3.0 FITC和羅丹明B異硫氰酸酯熒光標(biāo)記蛋白的熒光強(qiáng)度測(cè)定39-40
• 4.3.1 靶向性p53融合蛋白的細(xì)胞選擇性分析40-41
• 4.3.2 靶向性p53融合蛋白的活體成像檢測(cè)41-42
• 4.4 結(jié)論與分析42-45
• 第五章 靶向性p53融合蛋白的功能檢測(cè)及其機(jī)制研究45-53
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 5.1.1 細(xì)胞株45
• 5.1.2 主要試劑和儀器45-46
• 5.1.3 主要試劑的配制46
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 5.2.1 SH-SY5Y和U251細(xì)胞的培養(yǎng)46
• 5.2.2 靶向性p53融合蛋白的細(xì)胞活性鑒定46
• 5.2.3 細(xì)胞凋亡與壞死的檢測(cè)46-47
• 5.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡47
• 5.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)分析47
• 5.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47
• 5.3 結(jié)果47-51
• 5.3.1 靶向性p53融合蛋白的活性檢測(cè)47-48
• 5.3.2 靶向性p53融合蛋白的作用機(jī)制分析48-50
• 5.3.3 靶向性p53融合蛋白功能的進(jìn)一步確證50-51
• 5.4 結(jié)論與分析51-53
• 第六章 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 英文縮略說(shuō)明61-63
• 附錄63-65
• 致謝65-67
• 在讀期間發(fā)表論文67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫立超;李蘊(yùn)潛;宋紅梅;朱戰(zhàn)鵬;徐保鋒;馬程遠(yuǎn);邱吉慶;;P16功能性短肽對(duì)C6和U251細(xì)胞增殖的抑制作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年02期

2 孫 兵;神經(jīng)干細(xì)胞與腦腫瘤基因治療[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè);2002年03期

3 武軍華;魏文清;賈培媛;王晨宇;趙宇;劉晶;黃春倩;王玉霞;;競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中的P53蛋白[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2011年01期

4 付愛(ài)玲;趙寶全;陳亨宇;戰(zhàn)麗萍;;細(xì)胞穿透肽介導(dǎo)外源物質(zhì)入胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)度[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2012年02期

5 劉麗華;張明;;替莫唑胺誘導(dǎo)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞caspase非依賴的程序性死亡[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年02期

6 葉姣,陳長(zhǎng)華,夏杰,付水林,楊雅琴;溫度對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源蛋白表達(dá)的影響[J];華東理工大學(xué)學(xué)報(bào);2002年04期

7 張道寶;張列;余水;劉艷輝;劉家剛;相靜;毛慶;;伽瑪?shù)吨委熀驪53蛋白和PCNA蛋白在復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)的變化及其臨床意義[J];華西醫(yī)學(xué);2009年06期

8 肖榮剛;許佳俊;王晶;劉博;劉麗;孫君盈;王麗華;;熒光引導(dǎo)下行腦惡性膠質(zhì)瘤切除術(shù)患者的護(hù)理[J];解放軍護(hù)理雜志;2011年19期

9 路戈,劉春霞,計(jì)融;玉米赤霉烯酮單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的建立及初步應(yīng)用[J];真菌學(xué)報(bào);1996年04期

10 陳娟;盧光t;;CIK細(xì)胞的生物特性和應(yīng)用研究新進(jìn)展[J];腫瘤藥學(xué);2014年03期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 馮延葉;變性蛋白復(fù)性裝置研制及包涵體蛋白變性和復(fù)性技術(shù)研究[D];華東理工大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：靶向性p53融合蛋白的制備、檢測(cè)與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：341896