本文關(guān)鍵詞：血清中蓖麻毒素的生物質(zhì)譜分析方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蓖麻毒素是從大戟科蓖麻屬植物蓖麻種子中分離得到的一種異源二聚體的糖蛋白，分子量約為65KDa，由A鏈和B鏈組成，兩條多肽鏈通過鏈間二硫鍵相連。A鏈作為蓖麻毒素的活性鏈，可使核糖體失活，抑制蛋白質(zhì)合成；B鏈?zhǔn)潜吐槎舅氐慕Y(jié)合鏈，含有兩個半乳糖殘基結(jié)合位點(diǎn)，能夠與細(xì)胞表面上含有半乳糖的糖蛋白或糖脂結(jié)合，介導(dǎo)毒素分子以細(xì)胞內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而引發(fā)毒性作用。蓖麻毒素在腫瘤治療、生物農(nóng)藥等方面均有應(yīng)用，由于蓖麻毒素進(jìn)入細(xì)胞后，可在短時間內(nèi)阻止細(xì)胞蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種極強(qiáng)的毒性作用使其在生物安全、食品安全等方面存在著極大的隱患，一度被美國疾病控制和預(yù)防中心認(rèn)定為一種生物武器。因此，對該潛在生物戰(zhàn)劑檢測方法的研究從未間斷。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蓖麻毒素的檢測方法呈現(xiàn)出多樣性。目前研究較多的是基于抗體的免疫學(xué)分析方法，由于涉及抗體，其經(jīng)濟(jì)成本很高，并且分析過程較為復(fù)雜，耗時，通常分析一例樣本需要7小時左右。因此亟需開發(fā)一種簡便易行的蓖麻毒素快速分析方法。電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離的出現(xiàn)使得對過去難以檢測的蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物大分子的檢測成為可能。同時它們所具有的高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用和發(fā)展。磁珠技術(shù)是一種用于物質(zhì)分離與純化的新技術(shù)，根據(jù)研究物質(zhì)的不同可在其表面包被不同的化學(xué)基團(tuán)，再根據(jù)其磁性分離的特性對復(fù)雜環(huán)境中的樣品進(jìn)行分離和富集。本實驗室已成功合成銅螯合納米磁珠，將其應(yīng)用于血清中多肽的富集和純化，通過與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用可判斷急性白血病療效、診斷卵巢癌等，并成功建立了銅螯合納米磁珠結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對血清中的多肽類毒素-芋螺毒素的分析方法�；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，，本論文提出建立血清中大分子蛋白類毒素-蓖麻毒素的銅螯合納米磁珠結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速分析方法。 應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測蓖麻毒素樣品完整分子量，獲得[M+H]+峰，m/z63528Da。應(yīng)用變性劑將蓖麻毒素的A鏈和B鏈二硫鍵還原，再通過凝膠電泳技術(shù)分離，將A鏈及B鏈對應(yīng)的條帶進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白水解酶酶切，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。再應(yīng)用胰蛋白水解酶和糜蛋白水解酶分別對蓖麻毒素進(jìn)行溶液酶切，應(yīng)用超高效液相-電噴霧質(zhì)譜技術(shù)分析其特征肽段及肽序列信息，胰蛋白酶酶切后蛋白序列覆蓋率為61%，糜蛋白酶酶切后蛋白序列覆蓋率為42%，綜合覆蓋率82%。通過對蓖麻毒素A鏈含有活性位點(diǎn)肽段和蓖麻毒素B鏈蛋白C端肽段的序列分析，可明確該蓖麻毒素樣品的結(jié)構(gòu)信息，為后續(xù)銅螯合納米磁珠提取蓖麻毒素標(biāo)志肽段的選取提供依據(jù)。 為了進(jìn)一步改進(jìn)實驗進(jìn)程，我們應(yīng)用蛋白酶解變性劑RapiGest輔助胰酶酶切并摸索了酶切方法，將酶切時間從12小時縮短至3個小時，大大提高了實驗效率。為排除血清中本底水平的肽段對蓖麻毒素特征肽段的干擾，通過對磁珠提取血清肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析比對，排除血清肽段譜峰干擾，選取了[M+H]+為1728.8Da的肽段作為蓖麻毒素的特征性肽段用于鑒定。進(jìn)一步應(yīng)用超高效液相-電噴霧質(zhì)譜確定了[M+H]+為1728.8Da肽段序列SAPDPSVITLENSWGR。應(yīng)用上述建立的方法重復(fù)6次實驗，方法重復(fù)性良好，統(tǒng)計分析的結(jié)果m/z平均值為1728.94Da，CV為0.0016%，信噪比平均值為11.76，CV為16.10%。通過對銅螯合納米磁珠結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速分析血清中蓖麻毒素的檢測限研究，水溶液中蓖麻毒素的檢測限為2ng/μl，血清中的檢測限為5ng/μl。并經(jīng)過試驗證實，該方法也可以應(yīng)用于破傷風(fēng)素的鑒定。 本研究工作建立了一種銅納米螯合磁珠結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測血清中蓖麻毒素的方法，其原理是利用蛋白質(zhì)或多肽表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等與金屬離子產(chǎn)生配位結(jié)合，由于蛋白質(zhì)或多肽表面氨基酸的組成、位置和空間構(gòu)象不同，因此與金屬螯合物的親和力強(qiáng)弱也不同，從而選擇性地對其分離純化。該方法快速，簡便易行，且重復(fù)性良好。為蛋白質(zhì)類毒素的檢測提出了新的鑒定思路。為毒素分析領(lǐng)域向高通量、高靈敏度方向發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：銅螯合納米磁珠 生物質(zhì)譜 蓖麻毒素 檢測 血清
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R99
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-14
• 英文縮寫表14-15
• 第一章 緒論15-28
• 1.1 蓖麻毒素研究背景15-22
• 1.1.1 蓖麻毒素的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.2 蓖麻毒素的危害與毒性作用16-18
• 1.1.3 蓖麻毒素的應(yīng)用18-20
• 1.1.4 蓖麻毒素的檢測20-22
• 1.2 生物質(zhì)譜技術(shù)22-26
• 1.2.1 電噴霧質(zhì)譜22-23
• 1.2.2 基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜23
• 1.2.3 生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用23-26
• 1.3 金屬螯合納米磁珠提取技術(shù)26-27
• 1.3.1 金屬螯合納米磁珠提取技術(shù)原理26-27
• 1.3.2 金屬螯合納米磁珠提取技術(shù)的應(yīng)用27
• 1.4 本論文研究內(nèi)容27-28
• 第二章 蓖麻毒素結(jié)構(gòu)確證28-44
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 試劑28-29
• 2.1.2 溶液配制29-30
• 2.1.3 儀器30-31
• 2.1.4 分析軟件31
• 2.2 實驗方法31-34
• 2.2.1 蓖麻毒素蛋白定量31
• 2.2.2 蓖麻毒素完整分子量測定31
• 2.2.3 MALDI-TOF-MS 檢測蓖麻毒素 A 鏈、B 鏈肽指紋譜31-33
• 2.2.3.1 SDS-PAGE 法分離 A 鏈、B 鏈31-32
• 2.2.3.2 膠內(nèi)酶切32
• 2.2.3.3 酶切后肽段提取32
• 2.2.3.4 樣品脫鹽32-33
• 2.2.3.5 A 鏈、B 鏈肽指紋譜檢測33
• 2.2.4 UPLC-MS/MS 檢測蓖麻毒素溶液酶切后肽段33-34
• 2.2.4.1 蓖麻毒素溶液酶切33
• 2.2.4.2 樣品制備33
• 2.2.4.3 液相色譜分離條件33-34
• 2.2.4.4 四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置34
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析34
• 2.3 實驗結(jié)果34-43
• 2.3.1 蓖麻毒素定量結(jié)果34-35
• 2.3.2 蓖麻毒素的完整分子量35
• 2.3.3 SDS-PAGE 分離蓖麻毒素結(jié)果35-36
• 2.3.4 MALDI-TOF-MS 檢測蓖麻毒素 A 鏈、B 鏈肽指紋圖結(jié)果36-37
• 2.3.5 nanoUPLC-ESI-TOF-MS/MS 檢測酶酶切蓖麻毒素肽段結(jié)果37-43
• 2.3.5.1 蓖麻毒素酶切總離子流圖37-38
• 2.3.5.2 蓖麻毒素理論序列38-39
• 2.3.5.3 檢測酶切蓖麻毒素肽段覆蓋率39-42
• 2.3.5.4 蓖麻毒素重要特征肽段序列分析檢測42-43
• 2.4 小結(jié)43-44
• 第三章 銅螯合納米磁珠結(jié)合 MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析鑒定血清中蓖麻毒素44-62
• 3.1 材料45-46
• 3.1.1 試劑45
• 3.1.2 溶液配制45-46
• 3.1.3 儀器46
• 3.1.4 分析軟件46
• 3.2 實驗方法46-49
• 3.2.1 蛋白酶解變性劑對酶解效率的影響46
• 3.2.2 蓖麻毒素快速酶切46-47
• 3.2.3 銅螯合納米磁珠提取蓖麻毒素酶切溶液47
• 3.2.4 銅螯合納米磁珠提取酶切蓖麻毒素溶液質(zhì)譜檢測47
• 3.2.5 血清蛋白質(zhì)快速酶切47-48
• 3.2.6 銅螯合納米磁珠提取血清蛋白酶切溶液48
• 3.2.7 銅螯合納米磁珠提取血清蛋白酶切溶液質(zhì)譜檢測48
• 3.2.8 重復(fù)性試驗48
• 3.2.9 銅螯合納米磁珠提取蓖麻毒素酶切后特征肽段靈敏度48
• 3.2.10 磁珠提取結(jié)合 MALDI-TOF-MS 方法蓖麻毒素檢出限48
• 3.2.11 磁珠提取結(jié)合 MALDI-TOF-MS 方法在破傷風(fēng)毒素檢測中的應(yīng)用48-49
• 3.3 實驗結(jié)果49-60
• 3.3.1 蛋白酶解變性劑對酶解效率的影響49-50
• 3.3.2 銅螯合納米磁珠提取蓖麻毒素特征肽段結(jié)果50-52
• 3.3.3 銅螯合納米磁珠提取血清酶切肽段結(jié)果52-54
• 3.3.4 蓖麻毒素特征肽段挑選54-56
• 3.3.5 銅螯合納米磁珠富集標(biāo)志肽段結(jié)果56
• 3.3.6 方法重復(fù)性56-57
• 3.3.7 銅螯合納米磁珠結(jié)合 MALDI-TOF-MS 法分析水溶液中蓖麻毒素檢測限57-58
• 3.3.8 銅螯合納米磁珠結(jié)合 MALDI-TOF MS 法分析血清中蓖麻毒素的檢測限58-59
• 3.3.9 磁珠結(jié)合 MALDI-TOF-MS 方法在破傷風(fēng)毒素檢測中的應(yīng)用59-60
• 3.4 小結(jié)60-62
• 第四章 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-75
• 作者簡介及在學(xué)期間所獲科研成果75-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱倩;郭志強(qiáng);王宏偉;曹越;張宏斌;;中國蓖麻產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展建議[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年16期

2 王宗義;賀平麗;張麗英;楊文軍;李德發(fā);金曙光;;夾心ELISA快速檢測蓖麻粕中殘留的蓖麻毒素[J];飼料工業(yè);2006年17期

3 門金閂;王玉霞;;蓖麻毒素的毒性作用機(jī)制及其在腫瘤治療中的應(yīng)用[J];國際藥學(xué)研究雜志;2010年04期

4 王娜;董方霆;張學(xué)敏;李愛玲;王杰;王紅霞;李萍;吳勝明;楊曉虹;;水熱法制備質(zhì)譜專用提取多肽的金屬螯合納米磁珠[J];化學(xué)學(xué)報;2007年04期

5 丁愛華,牟金明,梁煊赫,王建新,張秋明;蓖麻、黑豆間作對黑豆主要害蟲防除效果的研究[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2003年06期

6 趙建興,張樹懷,佘國珍,烏云達(dá)來;蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2001年04期

7 蘇雅拉圖;黃鳳蘭;張繼星;李國瑞;呼和;吳俊華;;蓖麻毒蛋白的研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年04期

8 孫振鈞;呂麗媛;伍玉鵬;;蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展:從種植到利用[J];中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2012年06期

9 王晨宇;郎立偉;鐘玉環(huán);王玉霞;賈培媛;武軍華;李樺;;生物樣品中蓖麻毒素的雙夾心酶聯(lián)免疫定量檢測方法及應(yīng)用[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年08期

10 楊菁;鄭佳冰;曾曉芳;林禮務(wù);陳志奎;;蓖麻毒素溫敏型凝膠瘤內(nèi)注射治療耐藥卵巢癌的實驗研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：血清中蓖麻毒素的生物質(zhì)譜分析方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：336764