本文關(guān)鍵詞：超聲輻照聯(lián)合紫杉醇對(duì)三維腫瘤球細(xì)胞毒性效果評(píng)價(jià)及其機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的：目前抗癌藥物的篩選,一般在檢測(cè)體外單層細(xì)胞的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行,但這些研究結(jié)果與患者體內(nèi)實(shí)體腫瘤臨床評(píng)估的藥效存在一定偏差,產(chǎn)生這種差異的原因在于單層培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)單一,不能模擬體內(nèi)實(shí)體腫瘤的三維空間結(jié)構(gòu),無法真實(shí)反映體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的病理生理結(jié)構(gòu)及狀態(tài),這造成體外單層細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床參考意義受限。因此學(xué)者們致力于尋找一種新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?希望能有效彌補(bǔ)單層細(xì)胞模型所帶來的不足。近年來,許多學(xué)者建立了三維(three-dimentional,3D)腫瘤球模型,普遍認(rèn)為與二維(two-dimentional,2D)單層細(xì)胞相比,腫瘤球的生物學(xué)特性發(fā)生了明顯變化：擁有乏氧微環(huán)境,化療耐藥性增加,更能反應(yīng)體內(nèi)惡性腫瘤的特性。3D腫瘤球模型具有諸多優(yōu)點(diǎn)：①提供與體內(nèi)腫瘤組織相類似的上皮細(xì)胞間的緊密聯(lián)系；②擁有細(xì)胞外基質(zhì)組分；③模擬了實(shí)體腫瘤從外到內(nèi)的氧氣、營(yíng)養(yǎng)素、pH值和細(xì)胞增殖程度梯度遞減的變化特點(diǎn)；④相關(guān)基因、蛋白的分子生物學(xué)表達(dá)更似體內(nèi)腫瘤組織等。因此,以腫瘤球?yàn)閷?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯靠赡芨吲R床參考意義。目前腫瘤球常用的培養(yǎng)方法有：旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法、無血清懸浮培養(yǎng)法、懸滴法等,這些方法培養(yǎng)出的腫瘤球具有較強(qiáng)耐藥性能,同時(shí)能模擬實(shí)體腫瘤乏氧微環(huán)境。其中無血清懸浮培養(yǎng)法可用于篩選多種腫瘤干細(xì)胞,研究表明腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤產(chǎn)生化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因,因此本實(shí)驗(yàn)我們選擇無血清懸浮培養(yǎng)法,擬建立能模擬體內(nèi)腫瘤乏氧微環(huán)境,同時(shí)具備耐藥性能的3D腫瘤球模型。超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)技術(shù)是一種較具應(yīng)用前景的靶向給藥方法,通過在特定部位發(fā)射不同聲強(qiáng)的超聲波,致微泡破裂后產(chǎn)生空化效應(yīng)、微流、沖擊波、微射流等反應(yīng),在細(xì)胞表面形成可逆性小孔,即“聲孔效應(yīng)”,同時(shí)超聲(ultrasound, US)輻照區(qū)域的“液體流動(dòng)效應(yīng)”等均可促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn),從而增加靶細(xì)胞的藥物攝取。UTMD技術(shù)在單層細(xì)胞中促進(jìn)輻照區(qū)域藥物、基因、蛋白等攝取的研究已被廣泛報(bào)道,本課題組前期已開展UTMD技術(shù)在體外單層耐藥細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的相關(guān)研究,而目前UTMD技術(shù)輔助化療藥物應(yīng)用于腫瘤球的報(bào)道甚少。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌等多種不同類型癌癥治療的一線化療藥物。作為一種周期阻滯性藥物,紫杉醇能有效殺死快速增殖的腫瘤細(xì)胞,它的作用機(jī)制是在細(xì)胞分裂時(shí)通過穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu),干擾微管解聚而使細(xì)胞周期阻滯于有絲分裂期,由于缺少有絲分裂這一重要的過程,細(xì)胞無法進(jìn)行增殖,并最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。已有研究表明UTMD技術(shù)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)包括紫杉醇在內(nèi)的多種化療藥物的攝取,進(jìn)而增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。綜上所述,鑒于單層細(xì)胞培養(yǎng)模型在應(yīng)用上的局限性,同時(shí)考慮到不同種類腫瘤細(xì)胞對(duì)超聲的敏感性不同,為進(jìn)一步考察超聲輻照對(duì)不同種類腫瘤球的作用效果,本課題擬建立人乳腺癌MCF-7腫瘤球及人鼻咽癌5-8F腫瘤球模型,結(jié)合UTMD技術(shù)的生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而探討超聲輻照輔助紫杉醇對(duì)不同腫瘤球的影響,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。材料與方法：1.建立3D腫瘤球模型人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人鼻咽癌細(xì)胞5-8F分別以含10%胎牛血清的DMEM及RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。腫瘤球的培養(yǎng)是將經(jīng)消化后的MCF-7、5-8F細(xì)胞重懸于含生長(zhǎng)因子的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基后,接種于6孔培養(yǎng)板,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。2.3D腫瘤球和2D單層細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)差異檢測(cè)2.1流式細(xì)胞周期檢測(cè)收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、5-8F中瘤球及單層細(xì)胞,經(jīng)消化重懸成單細(xì)胞懸液,先后加入RNase A和PI各作用15 min,流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)各組的細(xì)胞周期差異。2.2熒光定量PCR檢測(cè)3D腫瘤球與2D單層細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)水平差異分別提取MCF-7、5-8F腫瘤球與單層細(xì)胞的RNA樣品,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后,熒光定量PCR對(duì)耐藥基因ABCB1、ABCG2、ABCC1,乏氧相關(guān)基因乏氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor, HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。2.3 CCK-8法檢測(cè)3D腫瘤球和2D單層細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性差異分別以不同濃度紫杉醇作用于MCF-7腫瘤球和MCF-7單層細(xì)胞、5-8F腫瘤球和5-8F單層細(xì)胞72 h后,CCK-8法測(cè)定各組的細(xì)胞相對(duì)存活率。3.脂質(zhì)微泡的制備及理化性質(zhì)鑒定按摩爾比稱取一定量的DSPC、DPPE于三頸瓶中,加入PEG4000、泊洛沙姆(F188),并加25 mL蒸餾水,70℃水浴攪拌30 min,冷卻至室溫。把制好的脂質(zhì)混懸液加入50 mL聚丙烯管內(nèi),將剪切刀頭插至液面下,通入全氟丙烷氣體2 min,以一定的剪切速度剪切一定時(shí)間,制得包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡(Microbubbles, MBs),分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉,并進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定。4.超聲輻照條件篩選在6孔培養(yǎng)板中分別種植MCF-7及5-8F腫瘤球,室溫下經(jīng)培養(yǎng)板底部分別對(duì)每區(qū)腫瘤球樣品進(jìn)行超聲輻照。輻照參數(shù)采用正交設(shè)計(jì)方法,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選定4因素,每因素3水平(占空比：10%,20%,50%；微泡濃度：10%,20%,30%；聲強(qiáng)：0.21 W/cm2,0.65 W/cm2,1.09 W/cm2;輻照時(shí)間：30s,60s,90s)設(shè)計(jì)正交表L27(313),結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DiI攝取率兩個(gè)觀察指標(biāo),優(yōu)化超聲輻照參數(shù)。5.在優(yōu)化的超聲輻照條件下考察3D腫瘤球?qū)ψ仙即嫉乃幬锩舾行苑謩e以(1)單獨(dú)紫杉醇,(2)超聲輻照聯(lián)合紫杉醇作用于MCF-7、5-8F腫瘤球。紫杉醇終濃度分別為1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 ug/mL、2 ug/mL 3 ug/mL、4 ug/mL、5ug/mL,每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,孵育72 h后CCK-8法測(cè)定各組的細(xì)胞相對(duì)存活率。6.優(yōu)化的超聲輻照條件下檢測(cè)3D腫瘤球?qū)iI的攝取情況分別設(shè)置MCF-7、5-8F腫瘤球的(1)空白對(duì)照組,(2)DiI組,(3)超聲輻照+DiI組,運(yùn)用上述所篩選出優(yōu)化的超聲輻照參數(shù)作用于MCF-7、5-8F腫瘤球,隨后加入等量DiI,所有樣品孵育24 h后,流式細(xì)胞儀定量分析各組的DiI熒光攝取量。7.檢測(cè)3D腫瘤球的細(xì)胞間隙及乏氧差異7.1 HE染色法(石蠟切片)：分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、5-8F腫瘤球用PBS漂洗2遍,4%多聚甲醛固定1.5 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,脫蠟染色,封片,鏡下觀察。7.2熒光定量PCR檢測(cè)MCF-7、5-8F腫瘤球的HIF-1α mRNA表達(dá)差異,方法同上。8. Western blot檢測(cè)超聲輻照對(duì)3D腫瘤球相關(guān)蛋白表達(dá)的影響分別提取未接受超聲輻照、超聲輻照后24 h、48 h、72 h的MCF-7、5-8F腫瘤球蛋白樣品各四組,western blot分析超聲輻照后耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp/ABCB1)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(breast cancer resistant protein, BCRP/ABCG2)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1/ABCC1),乏氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF,DNA損傷指標(biāo)γ-H2AX蛋白的表達(dá)情況。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。設(shè)計(jì)4因素3水平正交表,并按正交設(shè)計(jì)資料的方差分析對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；本實(shí)驗(yàn)余數(shù)據(jù)比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；將P0.05設(shè)為差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn),定義*為P0.05,**為P0.01,***為P0.001。結(jié)果：1.3D腫瘤球模型的成功建立MCF-7細(xì)胞和5-8F細(xì)胞均能在無血清的腫瘤球培養(yǎng)基中形成腫瘤球,根據(jù)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)速度上的差異分別選取培養(yǎng)了15 d (MCF-7)、7d (5-8F)的腫瘤球作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2.3D腫瘤球和2D單層細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)差異檢測(cè)2.1流式細(xì)胞周期檢測(cè)與單層細(xì)胞相比,MCF-7、5-8F腫瘤球的G1期細(xì)胞比例均增多,S期和G2/M期細(xì)胞比例均減少,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示兩種腫瘤球處于相對(duì)靜息期。2.2熒光定量PCR檢測(cè)3D腫瘤球與2D單層細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)水平差異與MCF-7單層細(xì)胞相比, MCF-7腫瘤球的ABCB1、ABCG2、HIF-1α、VEGF在mRNA水平上的表達(dá)分別為前者的4.87倍、2.53倍、2.08倍、2.56倍,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。相較5-8F單層細(xì)胞,在mRNA水平上5-8F腫瘤球的ABCG2、ABCC1、HIF-1α、VEGF表達(dá)分別為前者的3.46倍、1.49倍、4.05倍、2.22倍,其中除ABCCl外差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示成功建立了相對(duì)耐藥、擁有乏氧微環(huán)境的3D腫瘤球模型。2.3 CCK-8法檢測(cè)3D腫瘤球和2D單層細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性差異與單層細(xì)胞相比,無論是MCF-7或5-8F成球后均提高了對(duì)紫杉醇的耐藥性,紫杉醇的殺傷效果明顯減弱,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.脂質(zhì)微泡的理化性質(zhì)普通光學(xué)顯微鏡下觀察：制備得到的脂質(zhì)體微泡外觀圓整,分布均勻,無明顯聚集現(xiàn)象。庫爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得MBs濃度約為(3.93±1.0)×108個(gè)/mL,粒徑為(2.03±0.93)μm。4.超聲輻照條件篩選設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)篩選合適的超聲輻照參數(shù),結(jié)合各組細(xì)胞存活率及DiI攝取率兩個(gè)指標(biāo)確定超聲輻照各因素各水平的主次關(guān)系,分別選取占空比10%、微泡濃度10%、輻照時(shí)間60s及聲強(qiáng)0.65 W/cm2為MCF-7腫瘤球的適宜超聲輻照參數(shù)；對(duì)于5-8F腫瘤球,選取占空比20%、微泡濃度10%、輻照時(shí)間90s及聲強(qiáng)0.65 W/cm2為其適宜超聲輻照參數(shù)。5.在優(yōu)化的超聲輻照條件下考察3D腫瘤球?qū)ψ仙即嫉乃幬锩舾行栽谙嗤淖仙即紳舛茸饔孟?當(dāng)紫杉醇濃度處于相對(duì)低劑量(MCF-7腫瘤球：1 ng/mL;5-8F腫瘤球：2 ng/mL)時(shí),超聲輻照聯(lián)合紫杉醇作用組和單獨(dú)紫杉醇作用組對(duì)MCF-7或5-8F腫瘤球的細(xì)胞毒性作用無顯著差異(P0.05);當(dāng)紫杉醇濃度處于相對(duì)高劑量(MCF-7腫瘤球：1 ng/mL；5-8F腫瘤球：2ng/mL)時(shí),超聲輻照聯(lián)合紫杉醇作用組對(duì)MCF-7和5-8F腫瘤球均顯示出較好的殺傷效果,細(xì)胞存活率均明顯低于各自的單獨(dú)紫杉醇作用組(P0.05),提示適宜的超聲輻照條件可增強(qiáng)一定濃度范圍內(nèi)紫杉醇對(duì)MCF-7和5-8F腫瘤球的藥物毒性作用。6.優(yōu)化的超聲輻照條件下檢測(cè)3D腫瘤球?qū)iI的攝取情況優(yōu)化的超聲參數(shù)輻照均能促進(jìn)MCF-7、5-8F腫瘤球?qū)iI攝取,MCF-7腫瘤球的促進(jìn)幅度明顯高于5-8F腫瘤球(2.1倍VS 1.53倍),與上述CCK-8結(jié)果相符。提示超聲輻照可以增加腫瘤球細(xì)胞內(nèi)的藥物攝取。7.檢測(cè)3D腫瘤球的細(xì)胞間隙及乏氧差異7.1 HE結(jié)果顯示MCF-7腫瘤球細(xì)胞間隙較5-8F腫瘤球?qū)?腫瘤球內(nèi)細(xì)胞排列相對(duì)松散,后者球體結(jié)構(gòu)緊湊,細(xì)胞排列緊密。7.2腫瘤球HIF-1α mRNA表達(dá)差異：Q-PCR結(jié)果顯示5-8F腫瘤球HIF-1α的表達(dá)水平為MCF-7腫瘤球的1.48倍,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。這種差異的存在可能是因?yàn)閮煞N腫瘤球內(nèi)部的細(xì)胞間隙大小不一,超聲輻照使氧氣更易進(jìn)入間隙較大的MCF-7腫瘤球內(nèi)部,相對(duì)的高氧環(huán)境造成MCF-7腫瘤球HIF-1α mRNA的低表達(dá)。8. Western blot檢測(cè)超聲輻照對(duì)3D腫瘤球相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與無超聲作用的空白對(duì)照組相比,超聲作用后5-8F腫瘤球P-gp、BCRP、 MRP1、VEGF隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),HIF-1α表達(dá)量未見明顯變化；MCF-7腫瘤球在超聲輻照后P-gp隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)量少許增加,BCRP、MRP1、HIF-1α、 VEGF的表達(dá)量均未見明顯變化。提示不同種類腫瘤球蛋白表達(dá)對(duì)超聲輻照的響應(yīng)存在差異,超聲輻照可以下調(diào)5-8F腫瘤球部分耐藥、乏氧相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。9.DNA損傷指標(biāo)檢測(cè)對(duì)MCF-7和5-8F腫瘤球,均在超聲輻照72 h后檢測(cè)到γ-H2AX蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),提示超聲輻照可引起腫瘤球的DNA損傷,并可能進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖及相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)。結(jié)論1.促進(jìn)不同種類腫瘤球紫杉醇攝取的最佳超聲輻照參數(shù)不同；2.超聲輻照可促進(jìn)紫杉醇對(duì)腫瘤球的細(xì)胞毒性作用；3.超聲輻照促進(jìn)紫杉醇對(duì)腫瘤球細(xì)胞毒性作用的主要機(jī)制可能是：①聲孔效應(yīng)增加細(xì)胞膜的通透性；②輻照區(qū)域產(chǎn)生的液體流動(dòng)效應(yīng)和腫瘤球細(xì)胞間隙差異影響紫杉醇對(duì)腫瘤球內(nèi)部區(qū)域的滲透；③降低部分耐藥、乏氧相關(guān)蛋白的表達(dá);④誘導(dǎo)DNA損傷。4.超聲輻照對(duì)于不同種類腫瘤球的影響機(jī)制存在差異。
【關(guān)鍵詞】：超聲輻照 腫瘤球 微泡 紫杉醇
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-27
• 參考文獻(xiàn)24-27
• 第一章 建立三維腫瘤球模型及優(yōu)化超聲輻照參數(shù)27-50
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-46
• 4. 討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第二章 超聲輻照輔助增加紫杉醇對(duì)三維腫瘤球細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的相關(guān)機(jī)制研究50-65
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-59
• 4. 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 縮略詞65-66
• 成果66-67
• 附錄67-68
• 致謝68-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳智毅;謝明星;;超聲靶向破壞微泡技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2010年09期

  本文關(guān)鍵詞：超聲輻照聯(lián)合紫杉醇對(duì)三維腫瘤球細(xì)胞毒性效果評(píng)價(jià)及其機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：336072