本文關(guān)鍵詞：基于BIPES分析抗生素短期作用對小鼠腸道菌群的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微生物在自然界以群落形式廣泛存在。人體從內(nèi)到外充滿著數(shù)以億計的微生物,其中絕大多數(shù)棲息在人體的腸道內(nèi),它們參與了人體的營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育、新陳代謝、免疫分化以及保護機體免受病原體的侵害等多個方面,并發(fā)揮著重要的功能。然而腸道菌群很容易受到外界因素的干擾,譬如飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣改變、益生菌和抗生素的應(yīng)用等等,其中最被我們所熟知也是影響最為顯著的就是抗生素�？股刈鳛橐环N殺菌藥物自發(fā)現(xiàn)以來一直廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等各種領(lǐng)域,然而其濫用不僅會加劇耐藥性病原菌的傳播和轉(zhuǎn)移,同樣會破壞人體與菌群的相互關(guān)系。腸道菌群一旦紊亂將會導(dǎo)致一系列的功能性障礙和疾病,例如肥胖、腹瀉、炎癥性腸炎(IBD)、糖尿病(Ⅰ型和Ⅱ型)、大腸癌、自閉癥、哮喘等等。認清腸道菌群是如何影響人體的健康與疾病,需要我們將關(guān)注點從過去只針對個別的病原體,轉(zhuǎn)移以整體的角度研究菌群上來,特別是闡明正常的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)以及當(dāng)疾病發(fā)生時它們有何異常的差異。 利用第二代測序技術(shù)對細菌16S rRNA進行檢測,具有通量高,成本低廉的優(yōu)點,能夠顯著的改善傳統(tǒng)微生物研究方法的不足,獲得比較理想的微生物群落數(shù)據(jù),為我們研究微生物生態(tài)學(xué)奠定了良好的方法學(xué)基礎(chǔ)。 研究目的： 1、探求糞便總細菌基因組DNA高通量提取方法。建立不同濃度的煮沸法提取大鼠糞便基因組總DNA,并與常用商業(yè)DNA提取試劑盒法進行比較,通過分析不同DNA提取方法的α、β多樣性以及菌群結(jié)構(gòu),并重點比較他們中高豐度水平的OTU的統(tǒng)計學(xué)差異,以揭示不同DNA提取方法之間的異同,從而尋找快速、經(jīng)濟、高效、穩(wěn)定的DNA提取方案,為后期的研究分析奠定基礎(chǔ)。 2、比較不同給藥方式對小鼠腸道菌群的影響。選擇第三代頭孢菌素頭孢噻肟鈉,對BALB/C小鼠使用皮下注射和飲水口服兩種給藥方式同時給藥,并收集給藥前期、給藥中期、停藥后期三階段的糞便樣品,通過對不同給藥階段以及不同給藥方式的小鼠的腸道菌群進行比較,評估頭孢噻肟鈉不同給藥方式對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及多樣性的影響,并追溯其停藥后的恢復(fù)過程。3、比較不同抗生素對小鼠腸道菌群的影響。選擇四大類共六種抗生素,分別是p-內(nèi)酰胺類(頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、美羅培南)、喹諾酮類(左氧氟沙星)、糖肽類(萬古霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素),對BALB/C小鼠進行皮下注射給藥,并收集給藥前期、給藥中期、停藥后期三階段的糞便樣品,評價不同類型的抗生素,以及同類型的不同藥物對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的作用,并比較停藥后各自的恢復(fù)過程,擬探討抗生素對腸道菌群的影響,并為尋求耐藥機制提供線索,同時為我們探索抗生素長期或是反復(fù)作用提供研究基礎(chǔ)。 研究方法： 1、我們于成年健康SD大鼠肛門,直接收集新鮮糞便置于滅菌的5m1離心管中,-80℃冷凍保存。分別采用直接煮沸法：以0.5m1無菌EP管取1mgCBoil.1)、3mg (Boil.3)、5mg (Boil.5)、10mg (Boil.10)、30mg (Boil.30)鼠糞,分別加入100u1無菌ddH2O后振蕩均勻,先后經(jīng)過100℃15min,0℃10min。最后經(jīng)13000xg4℃離心5min后,取上清置于新的干凈離心管中,作為DNA模板。商業(yè)試劑盒法：選取MO BIO UltraClean Fecal DNA Isolation Kit(MO BIO)、 Qiagen QIAmp DNA mini KIT(Qiagen)、TIANGEN TIANamp Stool DNA kit (TG)、BIOEASY糞便總DNA磁珠法提取試劑盒(BMag)、BIOEASY細菌／細胞／動物組織基因組DNA過柱法(BCL)共五種常用商業(yè)試劑盒,按照各試劑盒說明說提取大鼠糞便總DNA,并溶于50ul TE緩沖液中。所有提取DNA模板置于-200C保存?zhèn)溆谩?2、我們將24只雄性BALB/C小鼠隨機分為3組(8只/組),保證每組小鼠的體重分布相一致。在預(yù)養(yǎng)一周后,對實驗組小鼠分別以皮下注射(CTX.i)與自然飲水口服(CTX.o)的方式進行為期4天的短期頭孢噻肟鈉給藥,對照組(CK)小鼠不做任何處理。分別收集各組小鼠給藥前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2、Ⅰ.3),給藥中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3、Ⅱ.4),停藥后期Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、Ⅲ.、Ⅲ.6、 Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三個時期的糞便樣品,所有的樣品取樣后立即置于-80℃冷凍保存。根據(jù)體重記錄,每組除去體重偏離中位數(shù)最遠的2只小鼠,對剩余6只小鼠的糞便進行DNA提取。 3、我們將56只雄性BALB/C小鼠隨機分為7組(8只/組),保證每組小鼠的體重分布相一致。在預(yù)養(yǎng)一周后,對各組小鼠分別進行為期的3天的短期給藥。各組小鼠按照編號分別皮下注射頭孢曲松鈉(CTR)、鹽酸左氧氟沙星(OFL)、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(CPZ)、萬古霉素(VAN)、美羅培南(MEC)、阿奇霉素(AZI),對照組(CK)小鼠注射等體重比的生理鹽水。分別收集給藥前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2),給藥中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3),停藥后期(Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、 Ⅲ.、Ⅲ.6、Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三個時期的糞便樣品,所有的樣品取樣后立即置于-80℃冷凍保存。根據(jù)體重記錄,每組除去體重偏離中位數(shù)最遠的2只小鼠,對剩余6只小鼠的糞便進行DNA提取。 我們以16s rRNA V6區(qū)域帶barcode的通用引物對所有提取的DNA進行PCR擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過混合、純化之后送至華大基因公司以Illumina Hiseq2000測序儀進行PE75測序。測序數(shù)據(jù)我們采用barcoded Illumina paired-end sequencing(BIPES)分析流程進行提取和初步處理,使用UCHIME篩選去除嵌合體；所得干凈序列經(jīng)Two-Stage-Clustering(TSC)以97%的相似度聚類成OTU(Operational Taxonomic Unit),并采用Global Alignment for Sequence Taxonomic(GAST)算法對其進行分類；采用mothur來獲得樣品的α多樣性信息；基于UniFrac距離,采用QIIME進行主成分分析；采用linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具尋找有組與組之間有統(tǒng)計學(xué)差異的Biomarker。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,P0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、采用直接煮沸法直接提取糞便樣品DNA,所得到的菌群結(jié)構(gòu)與使用商業(yè)試劑盒類似。當(dāng)采用較少量的糞便樣品進行直接煮沸法提取DNA時,會造成α多樣性被低估,然而當(dāng)糞便樣品量達到10-30mg時,所得到的α多樣性結(jié)果與采用200mg糞便進行提取的商業(yè)試劑盒相一致。p多樣性與菌群結(jié)構(gòu)的分析表明,直接煮沸法與除MO BIO之外的大部分試劑盒結(jié)果相一致。此外,幾乎所有中高豐度的OTU在所有的方法,包括直接煮沸法和試劑盒法中,都能夠被檢測到,這表明我們可以選用一致的方法更為有效的研究OTU在時間和空間上的變化。直接煮沸法僅使用少量的糞便(如10mg),能夠最大程度的降低對樣品量的需求,更適用于一些珍貴或取樣量較少的樣品,并且能顯著降低DNA提取的成本以及提高提取效率,為制備大批量樣品提供了新的解決之路,這對我們后續(xù)的研究起著重要的作用。 2、經(jīng)頭孢噻肟鈉給藥的小鼠其腸道菌群的α多樣性從給藥第二天開始出現(xiàn)顯著性下降,這種低水平的α多樣性并沒有隨著頭孢噻肟鈉的停用而立刻恢復(fù),而是持續(xù)了兩周的時間。而p多樣性同樣給我們展示了頭孢噻肟鈉對小鼠腸道菌群所造成的劇烈影響,這種菌群結(jié)構(gòu)上的改變比起a多樣性來更為持久和難以恢復(fù),在停藥后兩周的時間點上依然存在著顯著性差異。由此可得知,哪怕只是短時間的正常用藥,頭孢噻肟鈉也會對小鼠腸道菌群造成嚴(yán)重的影響,這種影響同時體現(xiàn)在α和p多樣性上,并遠比我們想象中漫長。通過采用LEfSe對生物標(biāo)志物的尋找,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)頭孢噻肟鈉給藥的小鼠,其腸道內(nèi)微生物在門水平上Bacteroidetes, Proteobacteria和Actinobacteria幾乎完全消失,而Firmicutes大量滋生。特別是對于有益菌Lactobacillus造成了災(zāi)難性的破壞,并恢復(fù)過程緩慢；而Clostridium, Bacillus和Enterococcus相對于對照組正常小鼠有著顯著性的增加。這種群落多樣性下降而Clostridum水平上升與艱難梭菌腹瀉(CDAD),特別是復(fù)發(fā)性CDAD相關(guān)。另一方面,口服給藥法給小鼠腸道細菌的總量造成了嚴(yán)重的影響,導(dǎo)致PCR以及后期測序所得序列均較不理想。但是從未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化序列進行UniFrac的結(jié)果以及所有能夠分析的數(shù)據(jù)上,我們可以看到注射和口服兩種給藥途徑對小鼠腸道菌群造成影響的趨勢基本是相似的。這予我們啟示,即為了保證后期測序分析的質(zhì)量,在同時存在口服和注射給藥途徑的情況下可以首選注射給藥。 3、本研究表明,所有的抗生素都會對小鼠腸道菌群α多樣性造成影響,其中OFL與AZI對小鼠腸道菌群a多樣性的影響相對較輕微,在停藥后第4天均已恢復(fù)到正常水平；而CTR、CPZ、VAN與MEC對α多樣性影響則更為相似,在停藥后兩周才基本恢復(fù)正常。從p多樣性的角度來看,OFL與AZI對小鼠腸道菌群的影響并不是十分顯著,CTR組、CPZ組、VAN組與MEC組的腸道菌群則都在給藥的第二天發(fā)生了劇烈的變化。并且不同的抗生素對于不同豐度的OTU的具有選擇性作用,CTR、CPZ和MEC這三種藥物主要作用于腸道菌群中一些豐度不高的OTU上,VAN組則更多地作用于一些中高豐度的OTU上。另一方面,隨著藥物的停用,不同的抗生素也表現(xiàn)出不同的恢復(fù)趨勢。CTR組與MEC組的腸道菌群到停藥后第14天才恢復(fù)到正常,而CPZ組到停藥后第30天才恢復(fù),VAN組更是直到停藥后第90天才完全恢復(fù)正常。 從菌群結(jié)構(gòu)上我們可以發(fā)現(xiàn),在門水平級別上,β-內(nèi)酰胺類的抗生素組的三種藥物變化更為相似,均以抗生素作用下Firmicutes增加,Bacteroidetes與Proteobacteria減少為特征；然而具體三種藥物的作用仍有一定的區(qū)別,CPZ組Firmicutes水平的升高主要發(fā)生于停藥后期,而CTR與MEC主要發(fā)生于給藥中期。OFL組與AZI組變化呈現(xiàn)輕微的波動但不明顯,OFL組可以觀察到Proteobacteria水平隨著給藥開始下降,并直到觀察期結(jié)束依然保持著較低水平。VAN組顯現(xiàn)出明顯異于其他給藥組的菌群變化,即Firmicute水平隨著給藥大幅度下降,而Proteobacteria則占據(jù)了小鼠腸道菌群中的主導(dǎo)地位。進一步從屬水平上可以發(fā)現(xiàn),只有VAN組反常的在給藥中期出現(xiàn)了Escherichia增高的情況,造成這點的原因主要是由于萬古霉素的殺菌譜重點偏向于殺滅革蘭氏陽性菌,從而造成革蘭氏陰性菌的定植與增生。而VAN組在停藥2周之后,Clostridium水平略有增加,并在整個觀察期結(jié)束時仍未恢復(fù),我們推測此為VAN對小鼠腸道菌群的所造成遠期影響之一。喹諾酮類藥物OFL對小鼠腸道菌群的影響相對較輕微,為我們臨床用藥選擇提供了指導(dǎo)和借鑒。大環(huán)內(nèi)酯類藥物AZI主要作用于Bacteroidetes門的細菌,并對于豐度較低的菌屬影響較大。此外,三種β-內(nèi)酰胺類藥物的抗生素(CTR、CPZ、MEC)在殺菌譜上表現(xiàn)出了一定的一致性,都是以殺滅Firmicutes和Bacteroidetes為主的菌群并造成Clostridium大量增生,這點在其他類型的抗生素上并未有相似表現(xiàn)。綜合前研究頭孢噻肟鈉我們可以發(fā)現(xiàn)驚人的一致性,這種多樣性降低而Clostridium增長的趨勢有可能p-內(nèi)酰胺類抗生素易導(dǎo)致艱難梭菌感染的一個重要原因。盡管如此,β-內(nèi)酰胺的三種抗生素有他們各自的作用特點,譬如CTR組與MEC組的Clostridium水平隨著藥物的給予立即上升,而CPZ組的Clostridium水平最高峰反而出現(xiàn)在停藥后期,其恢復(fù)過程也不盡相同。 研究結(jié)論： 1、本研究建立了糞便直接煮沸法,并證明了其與普通商業(yè)試劑盒法無顯著差異,為后期實驗?zāi)軌蚩焖�、有效、�?jīng)濟的對大批量樣品進行DNA提取提供了基礎(chǔ)。 2、盡管只是短期用藥,頭孢噻肟鈉依然會對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性造成嚴(yán)重的影響,并且這一影響隨著藥物的停用依然會持續(xù)較長一段時間。此外,不同的給藥方式對小鼠腸道菌群的影響趨勢相一致。 3、不同的抗生素擁有不同的抗菌譜,在給藥中期會對小鼠腸道菌群造成不同的作用,而藥物停用之后不同的抗生素給藥組恢復(fù)時間以及菌群變化情況也大相徑庭,其中某些藥物的恢復(fù)情況為我們臨床更合理的使用抗生素提供線索。
【關(guān)鍵詞】：微生物組 DNA提取抗生素第二代測序腸道菌群
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 實驗操作及測序分析流程22-24
• 第一章 建立直接煮沸法快速有效的進行DNA提取24-44
• 1.1 引言24-26
• 1.2 材料與方法26-31
• 1.3 結(jié)果與討論31-42
• 1.4 結(jié)論42-44
• 第二章 頭孢噻肟鈉不同給藥方式對小鼠腸道菌群的影響44-59
• 2.1 引言44-45
• 2.2 材料與方法45-47
• 2.3 結(jié)果與討論47-57
• 2.4 結(jié)論57-59
• 第三章 多種抗生素皮下注射對小鼠腸道菌群的影響59-95
• 3.1 引言59-61
• 3.2 材料與方法61-62
• 3.3 結(jié)果與討論62-91
• 3.4 結(jié)論91-95
• 總結(jié)95-96
• 參考文獻96-105
• 成果105-106
• 附錄106-112
• 致謝112-113

【共引文獻】

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本文編號：329227