本文關(guān)鍵詞：羧甲基殼聚糖促進(jìn)口服藥物腸道吸收機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：許多具有特異療效的生物大分子藥物采用口服給藥難以通過腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán),極大地限制了其應(yīng)用。殼聚糖(Chitosan, CS)作為口服藥物載體具有打開上皮細(xì)胞緊密連接(TJ)增強(qiáng)藥物細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)哪芰?殼聚糖／羧甲基殼聚糖(CS/CMC S)納米載體能夠更有效地促進(jìn)口服藥物透腸吸收,提高口服生物利用度,但CMCS結(jié)構(gòu)與腸道細(xì)胞作用的分子機(jī)制尚不明確。本文通過制備具有不同取代度的CMCS材料體系,以Caco-2細(xì)胞構(gòu)建腸道吸收模型,研究了CMCS不同分子結(jié)構(gòu)與其作為載體材料促進(jìn)口服藥物透腸吸收之間的關(guān)系。利用殼聚糖(CS)與氯乙酸反應(yīng)技術(shù),通過控制反應(yīng)時(shí)間,成功合成了三種羧甲基殼聚糖(CMCS)樣品,分別命名為CMCS1、CMCS2和CMCS3。在中性條件下,CMCS2和CMCS3比CMCS1表現(xiàn)出更好的水溶性；三種CMCS樣品紅外光譜圖證實(shí)羧甲基基團(tuán)(-CH2COOH)成功地連接到了CS的分子骨架上,羧基特征峰面積的差異反映出羧基含量的不同：CS原料的分子量為397.5kDa, CMCS1、CMCS2、CMCS3的分子量分別為449.1kDa、540.7kDa和605.1kDa,羧甲基取代度分別為36%、100%、145%,產(chǎn)物的分子量和取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增大。CMCS1和CMCS2的羧甲基取代主要發(fā)生在C6位的-OH上,產(chǎn)物以O(shè)-CMCS為主。CMCS3的羧甲基取代在C6位的-OH達(dá)到飽和后繼續(xù)發(fā)生在C2位的-NH2上,生成產(chǎn)物主要為N,O-CMCS;三種CMCS樣品中由于引入了羧基基團(tuán)(-COO-),其Ca2+螯合能力均顯著高于CS原材料,且隨著羧甲基基團(tuán)取代度的增加,Ca2+螯合能力逐漸增強(qiáng)。通過MTT法評價(jià)了CS原料和三種取代度CMCS樣品的細(xì)胞毒性,72h實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,浸提液濃度在0.0625mg/mL-1mg/mL范圍內(nèi),各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對增殖率均超過1 00%,四種材料對HUVEC、MEF和Caco-2細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。并且,CS、CMCS1、CMCS2和CMC3對HUVEC和MEF的生長都有明顯的促進(jìn)作用,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),促生長作用隨著材料浸提液濃度的提高而增強(qiáng)。TEER分析結(jié)果表明,0.25mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/ml濃度的CS和三種CMCS樣品浸提液處理Caco-2細(xì)胞致密單層后,細(xì)胞單層TEER值在1h內(nèi)表現(xiàn)為先迅速下降后逐漸上升。TEER值降低速度隨材料濃度的增加而增大,TEER值最大降幅隨CMCS羧甲基取代度的增大而增大。全部實(shí)驗(yàn)組對Caco-2細(xì)胞致密單層作用過程均表現(xiàn)出可逆性。其中,05 mg/ml和1mg/ml CMCS3具有明顯較強(qiáng)的打開細(xì)胞TJ的能力。緊密連接蛋白Claudin-4免疫熒光研究發(fā)現(xiàn),0.5 mg/ml的CS和CMCS3作用前,細(xì)胞膜上存在大量Claudin-4蛋白,細(xì)胞間的TJ處于完整狀態(tài)；作用15min后,熒光信號明顯減弱,Claudin-4蛋白急劇減少,細(xì)胞間TJ被打開；作用30min和60min后,熒光信號明顯增強(qiáng),Claudin-4蛋白量持續(xù)增加,細(xì)胞間TJ逐漸恢復(fù)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TEER分析結(jié)果一致,均證實(shí)CMCS3能夠有效打開Caco-2細(xì)胞之間的TJ結(jié)構(gòu),從而增加細(xì)胞旁通路的滲透性。研究發(fā)現(xiàn),高取代度的CMCS表現(xiàn)出更強(qiáng)的打開細(xì)胞TJ的能力。一方面依賴于其介導(dǎo)的跨膜蛋白Claudin-4在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移和重新分布,另一方面通過其更強(qiáng)的Ca2+螯合能力使鈣粘素因Ca2+流失而失活,破壞細(xì)胞粘附連接(AJ)結(jié)構(gòu)進(jìn)而打開細(xì)胞TJ。該研究結(jié)果為對羧甲基殼聚糖載體材料進(jìn)行精確的分子設(shè)計(jì),研究與開發(fā)高效、安全的口服藥物載體奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：殼聚糖 羧甲基殼聚糖 腸道吸收 緊密連接 細(xì)胞毒性
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 前言14-27
• 1 口服藥物應(yīng)用現(xiàn)狀14-16
• 1.1 口服藥物現(xiàn)狀14-16
• 1.1.1 藥物口服吸收機(jī)制14
• 1.1.2 藥物吸收的影響因素14-16
• 1.2 存在問題16
• 2 口服藥物材料研究進(jìn)展16-20
• 2.1 口服藥物載體材料簡述16-17
• 2.2 殼聚糖介紹17-20
• 2.2.1 殼聚糖(CS)17-18
• 2.2.2 殼聚糖衍生物載體材料研究18-20
• 3 口服藥物載體促腸上皮吸收機(jī)理研究進(jìn)展20-22
• 3.1 研究現(xiàn)狀20-21
• 3.1.1 透粘膜機(jī)理20-21
• 3.1.2 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)介紹21
• 3.2 殼聚糖及其衍生物促吸收機(jī)理研究21-22
• 3.2.1 殼聚糖(CS)21-22
• 3.2.2 羧甲基殼聚糖(CMCS)22
• 3.2.3 N-三甲基殼聚糖季銨鹽(TMC)22
• 3.2.4 其它22
• 4 立題依據(jù)及研究內(nèi)容22-27
• 4.1 立楲依據(jù)22-24
• 4.2 研究內(nèi)容24-26
• 4.3 技術(shù)路線26-27
• 第一章 羧甲基殼聚糖的制備及理化性質(zhì)分析27-39
• 0 引言27
• 1 試劑與設(shè)備27-28
• 1.1 主要材料與試劑27-28
• 1.2 主要儀器設(shè)備28
• 2 方法28-30
• 2.1 不同取代度羧甲基殼聚糖(CMCS)的制備28-29
• 2.2 紅外光譜的測定29
• 2.3 分子量的測定29
• 2.4 取代度的測定29-30
• 2.5 Ca~(2+)螫合能力的測定30
• 3 結(jié)果與討論30-37
• 3.1 不同取代度的羧甲基殼聚糖(CMCS)的制備30-31
• 3.2 紅外光譜分析31-33
• 3.3 分子量測定33
• 3.4 取代度分析33-36
• 3.5 Ca~(2+)螯合能力分析36-37
• 4 小結(jié)37-39
• 第二章 不同取代度羧甲基殼聚糖(CMCS)體外細(xì)胞安全性評價(jià)39-46
• 0 引言39
• 1 材料39-40
• 1.1 藥品與試劑39-40
• 1.2 主要儀器設(shè)備40
• 2 方法40-42
• 2.1 HUVEC細(xì)胞毒性檢測40-42
• 2.1.1 傳代培養(yǎng)40-41
• 2.1.2 浸提液的制備41
• 2.1.3 MTT法檢測細(xì)胞的相對增殖率41-42
• 2.2 MEF細(xì)胞毒性檢測42
• 2.2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)42
• 2.2.2 浸提液的制備42
• 2.2.3 MTT法檢測細(xì)胞的相對增殖率42
• 2.3 Caco-2細(xì)胞毒性檢測42
• 3 結(jié)果與討論42-45
• 3.1 HUVEC細(xì)胞毒性評價(jià)43-44
• 3.2 MEF細(xì)胞毒性評價(jià)44
• 3.3 Caco-2細(xì)胞毒性評價(jià)44-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第三章 不同取代度羧甲基殼聚糖(CMCS)對Caco-2細(xì)胞構(gòu)建的體外腸道吸收模型作用的研究46-61
• 0 引言46
• 1 材料46-48
• 1.1 藥品和試劑46-47
• 1.2 主要儀器設(shè)備47-48
• 2 方法48-50
• 2.1 細(xì)胞跨膜電阻(TEER)測定48-49
• 2.1.1 Cac-2細(xì)胞致密單層吸收模型的構(gòu)建48
• 2.1.2 浸提液的制備48
• 2.1.3 細(xì)胞TEER測定48-49
• 2.2 免疫熒光分析49-50
• 2.2.1 Caco-2細(xì)胞的接種與培養(yǎng)49
• 2.2.2 溶液的制備49
• 2.2.3 細(xì)胞的處理49-50
• 3 結(jié)果與討論50-60
• 3.1 不同材料對細(xì)胞跨膜電阻(TEER)的影響50-56
• 3.3.1 材料浸提液濃度對細(xì)胞跨膜電阻(TEER)的影響50-54
• 3.3.2 材料羧甲基取代度對細(xì)胞跨膜電阻(TEER)的影響54-56
• 3.2 材料對細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白作用的免疫熒光分析56-59
• 3.3 羧甲基殼聚糖對Caco-2細(xì)胞致密單層作用機(jī)制的分析59-60
• 4 小結(jié)60-61
• 全文總結(jié)61-63
• 創(chuàng)新點(diǎn)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 附錄68-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡歷71
• 所獲榮譽(yù)及獎勵(lì)71
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文71

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