本文關(guān)鍵詞：單克隆抗體藥物及其糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的基于蛋白質(zhì)組學的研究方法,對貝伐珠(Bevacizumab)單克隆抗體藥物進行了肽譜和糖基化修飾形態(tài)的定性分析,建立測定貝伐珠單抗及其糖基化修飾的質(zhì)譜定量分析方法,測定大鼠在不同給藥劑量下血漿樣品中單抗藥物濃度,繪制貝伐珠單抗的藥物濃度-時間曲線,同時測定貝伐珠單抗糖基化修飾的17種糖型的相對含量,繪制相對含量-時間曲線,考察單抗藥物本身及其糖基化修飾在體內(nèi)的藥代動力學特征,為藥物研發(fā)和臨床安全用藥的研究提供新的途徑及理論依據(jù)。研究方案利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)對完整貝伐珠單抗的分子量進行表征;利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對貝伐珠單抗在完整蛋白層次以及輕、重鏈層次考察其糖基化修飾情況;通過對貝伐珠單抗進行胰蛋白酶水解,采用shot-gun蛋白質(zhì)組學策略對貝伐單抗的實際胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段進行全面分析表征;通過對貝伐珠單克隆抗體藥物進行胰蛋白酶水解,同時利用肽糖苷酶F(Peptide-N-glycosidase F,PNGase F)進行去糖基化處理,結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)和搜庫軟件實現(xiàn)對貝伐珠單抗糖基化修飾的全面表征,確定其糖基化修飾位點及存在糖型。通過對貝伐珠單抗藥物進行胰蛋白酶水解,采用shot-gun蛋白質(zhì)組學策略篩選出能代表貝伐珠單抗的特征肽段;利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),通過優(yōu)化液相條件與質(zhì)譜參數(shù),采用平行反應(yīng)監(jiān)測模式(Parallel reaction monitoring,PRM)建立針對貝伐珠單抗特征肽段的LC-MS/MS測定方法;通過胰蛋白酶酶解結(jié)合固相萃取技術(shù)實現(xiàn)血漿樣品的制備;實驗中合成穩(wěn)定同位素標記的特征肽段做內(nèi)標,通過內(nèi)標法建立貝伐珠單抗大鼠血漿標準曲線;最后,通過測定大鼠給藥后血漿樣本,得到不同給藥劑量下的貝伐珠單抗的藥物濃度-時間曲線。利用lc-ms/ms技術(shù),通過優(yōu)化液相條件與質(zhì)譜參數(shù),采用prm模式,建立針對貝伐珠單抗糖基化修飾各糖型的lc-ms/ms測定方法;通過胰蛋白酶酶解結(jié)合固相萃取技術(shù)實現(xiàn)血漿樣品的制備;通過測定大鼠給藥后血漿樣本,考察不同給藥劑量下的糖基化修飾變化情況;通過優(yōu)化親水富集條件確定親水富集樣品制備方法;最后,通過對血漿樣品直接分析未檢測到的糖型進行親水富集,考察利用親水富集手段檢測實際樣品的優(yōu)勢。研究結(jié)果本研究建立了對貝伐珠單抗及其糖基化修飾的質(zhì)譜定性分析方法。結(jié)果表明貝伐珠單抗分子量約為150kda,輕鏈分子量約為25kda,重鏈分子量約為50kda,糖基化修飾中的糖鏈分子量主要集中在2~4kda。貝伐珠單抗的n-糖基化修飾位點位于重鏈的第303位天冬酰胺殘基上。經(jīng)胰蛋白酶水解后,糖基化修飾所在的肽段序列為eeqynstyr。利用建立的方法表征到貝伐珠單抗的17種糖型,包括h3n3、h4n4、h3n4、h4n3f1、h4n4f1、h3n3f1、h3n4f1、h3n5f1、h5n2、h6n2、h5n4f1、h8n2、h5n5、h4n3f1s1、h5n3f1、h6n3f1和h4n5。本研究確定了貝伐珠單抗的特征肽段,序列為ftfsldtsk,并合成了穩(wěn)定同位素標記的肽段做內(nèi)標,建立了對復(fù)雜基質(zhì)中的貝伐珠單抗的prm定量方法。用于對特征肽段及內(nèi)標肽段進行prm監(jiān)測的母離子質(zhì)荷比(mass-to-chargeratio,m/z)分別為523.26和526.88,提取離子m/z分別為797.39和805.41,采用內(nèi)標法建立了貝伐珠單抗大鼠血漿標準曲線,線性范圍為0.005-1.2μg/μl,標準曲線為y=0.0684449x-0.000239987(r2=0.9980)。對高低劑量給藥的大鼠血漿樣品進行了檢測,獲得的藥物濃度-時間曲線趨勢一致。本研究同時對貝伐珠單抗的糖基化修飾的17種糖肽進行了定量分析。結(jié)果表明,不同糖型在體內(nèi)的代謝情況也不完全一致。同時提供了一種親水富集糖肽的方法,為低豐度糖肽的分析提供了更具優(yōu)勢的方法。通過以上實驗,建立了對單克隆抗體藥物及其糖基化修飾的定性、定量分析方法,為藥物代謝動力學研究提供了新思路、新方法。
【關(guān)鍵詞】：單克隆抗體藥物 糖基化修飾 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 平行反應(yīng)監(jiān)測 絕對定量
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R917
【目錄】：

• 摘要4-7
• abstract7-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 單克隆抗體藥物簡介13-15
• 1.2 基于MRM技術(shù)的蛋白藥物定量方法15-17
• 1.3 單克隆抗體藥物糖基化修飾簡介17-18
• 1.4 單抗藥物糖基化修飾分析方法18-22
• 1.4.1 整體蛋白水平的MS分析和CE分析18-19
• 1.4.2 糖鏈水平的分析19-20
• 1.4.3 糖肽水平的直接分析20-21
• 1.4.4 糖肽水平的富集分析21-22
• 1.5 實驗?zāi)康募把芯糠桨?/span>22-23
• 第2章 單克隆抗體藥物及其糖基化修飾的表征23-39
• 2.1 實驗?zāi)康?/span>23
• 2.2 實驗部分23-27
• 2.2.1 儀器與設(shè)備23
• 2.2.2 藥品與試劑23-24
• 2.2.3 溶液配制24
• 2.2.4 色譜與質(zhì)譜條件24
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理24-25
• 2.2.6 完整貝伐珠單抗的稀釋及去糖基化25
• 2.2.7 完整單抗及其糖基化修飾的MALDI-TOF MS表征25-26
• 2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳26
• 2.2.9 貝伐珠單抗標準品的酶解及去糖基化26-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-39
• 2.3.1 基于MALDI-TOF MS表征完整單抗及其糖基化修飾27-29
• 2.3.2 基于SDS-PAGE的單抗藥物表征29-30
• 2.3.3 基于LC-MS/MS的單抗藥物胰蛋白酶酶解考察30-32
• 2.3.4 貝伐珠單抗糖基化的表征32-39
• 第3章 單克隆抗體藥物的體內(nèi)定量分析方法39-46
• 3.1 實驗?zāi)康?/span>39
• 3.2 實驗部分39-42
• 3.2.1 儀器與設(shè)備39
• 3.2.2 藥品與試劑39
• 3.2.3 給藥方案與血漿樣品采集39-40
• 3.2.4 色譜與質(zhì)譜條件40
• 3.2.5 貝伐珠單抗標準系列溶液及內(nèi)標肽段溶液的配制40-41
• 3.2.6 標準曲線樣品的制備41
• 3.2.7 大鼠血漿樣品的酶解41-42
• 3.3 結(jié)果與分析42-46
• 3.3.1 特征肽段的確定及色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化42-44
• 3.3.2 大鼠血漿標準曲線的建立44
• 3.3.3 不同劑量給藥大鼠血漿的測定44-46
• 第4章 單克隆抗體藥物糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法46-65
• 4.1 實驗?zāi)康?/span>46
• 4.2 實驗部分46-49
• 4.2.1 儀器與設(shè)備46
• 4.2.2 藥品與試劑46-47
• 4.2.3 給藥方案與血漿樣品采集47
• 4.2.4 色譜與質(zhì)譜條件47-48
• 4.2.5 糖肽富集方法的優(yōu)化48-49
• 4.2.6 大鼠血漿樣品的酶解49
• 4.2.7 大鼠血漿樣品的富集49
• 4.3 結(jié)果與分析49-65
• 4.3.1 大鼠血漿樣品的測定49-62
• 4.3.2 糖肽富集方法的優(yōu)化62-63
• 4.3.3 糖肽富集的優(yōu)勢63-65
• 第5章 結(jié)論與展望65-67
• 參考文獻67-75
• 作者簡介及科研成果75-77
• 致謝77

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 郭永;韓穎;扈文博;權(quán)國波;劉敏霞;劉安;;糖基化修飾血小板冷藏穩(wěn)定性研究[J];中國實驗血液學雜志;2008年03期

2 何椿鵬;華玲;楊小盼;萬德有;李萌萌;王清清;陳方;董立厚;高新;高月;宋海峰;;不同腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白N-糖基化修飾糖鏈的初步分析[J];國際藥學研究雜志;2013年03期

3 李佳佳;楊竹;王應(yīng)雄;于超;;白細胞介素1β通過β1整合素糖基化修飾誘導(dǎo)EA.hy926細胞凋亡[J];中國藥理學通報;2012年07期

4 段春燕;陳紹坤;張春燕;馮春紅;劉友平;夏先明;余文靜;代榮陽;李洪;;pro-Met的N-糖基化修飾對c-Met功能的影響[J];世界華人消化雜志;2014年20期

5 錢慰,劉飛,龔成新,金淑儀;重組O-GLcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶在昆蟲細胞中的表達和純化[J];南通醫(yī)學院學報;2003年01期

6 邱近明;氧化與糖基化修飾低密度脂蛋白和動脈粥樣硬化[J];中國動脈硬化雜志;1995年02期

7 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉東輝;鄭樂民;;無酶糖基化修飾損害了載脂蛋白A-I的抗炎功能[A];中國病理生理學會第九屆全國代表大會及學術(shù)會議論文摘要[C];2010年

2 金尚卉;侯丙凱;;植物生長素糖基化修飾功能基因初步鑒定與分析[A];山東植物生理學會第七次代表大會暨植物生物學與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研討會論文集[C];2012年

3 金尚卉;韓萍;侯丙凱;;植物赤霉素糖基化修飾關(guān)鍵功能基因初步鑒定與分析[A];植物分子生物學與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國植物生物學研討會論文摘要集[C];2010年

4 郭永;王捷熙;權(quán)國波;劉敏霞;王艷;楊超;扈文博;高峰;韓穎;;冷藏人血小板糖基化修飾穩(wěn)定性及功能的研究[A];第五屆全國低溫生物醫(yī)學及器械學術(shù)大會會議論文集[C];2006年

5 高春芳;;異常糖基化修飾檢測在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用前景[A];中華醫(yī)學會第八次全國檢驗醫(yī)學學術(shù)會議暨中華醫(yī)學會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

6 郭永;王捷熙;權(quán)國波;王艷;劉敏霞;劉安;韓穎;;糖基化修飾后人血小板超微結(jié)構(gòu)及功能的研究[A];中國輸血協(xié)會第四屆輸血大會論文集[C];2006年

7 沈姝;王曼麗;李鑫;李淑芬;鄧菲;Just M.Valk;Ineke Braakman;胡志紅;王華林;;棉鈴蟲核多角體病毒膜融合蛋白N-糖基化修飾的突變和功能研究[A];2013年湖北省暨武漢微生物學會會員代表大會暨學術(shù)年會論文摘要集[C];2013年

8 王軍;馬新梅;侯丙凱;;植物細胞分裂素N-糖基化修飾功能基因研究[A];2011全國植物生物學研討會論文集[C];2011年

9 馬新梅;王軍;侯丙凱;;植物細胞分裂素O-糖基化修飾功能基因研究[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

10 韓歡歡;賈偉;盧莊;應(yīng)萬濤;張養(yǎng)軍;秦偉捷;錢小紅;;肝病相關(guān)糖基化修飾蛋白質(zhì)的研究[A];生命的分子機器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國生物化學與分子生物學學術(shù)大會摘要集[C];2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 黃婉;CD147分子N-糖基化修飾的功能研究及其在腫瘤進展中的意義[D];第四軍醫(yī)大學;2012年

2 孔凡樓;晚期糖基化修飾誘導(dǎo)β_2微球蛋白聚集及其毒性機理研究[D];武漢大學;2011年

3 史艷秋;糖基化修飾對抗腫瘤藥物生物活性影響的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2006年

4 徐嵐;骨唾液酸蛋白糖基化修飾對成骨的影響[D];蘇州大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 叢宇婷;單克隆抗體藥物及其糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法研究[D];吉林大學;2016年

2 韓珠;BST-2的糖基化修飾對其抑制細胞內(nèi)部病毒的作用研究[D];吉林大學;2016年

3 郭永;糖基化修飾延長冷藏血小板體內(nèi)壽命的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

4 孫晟軒;人臍血內(nèi)皮祖細胞糖基化修飾及其在骨折修復(fù)中的作用及機制研究[D];蘇州大學;2014年

5 阮韋偉;糖基修飾改性對擬穴青蟹過敏原性質(zhì)的影響[D];集美大學;2012年

6 葛曉幸;GOLPH2的糖基化修飾對于其參與肝癌發(fā)生的影響[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

7 車鳳玉;人胰島素原基因的N-糖基化修飾及其表達[D];江蘇科技大學;2013年

8 楊洋;人朊蛋白N-糖基化修飾對體外誘導(dǎo)細胞凋亡作用的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

9 石小蕊;N糖基化修飾對B7-H3生物學功能影響的初步研究[D];蘇州大學;2013年

10 姜江;調(diào)節(jié)Matriptase-2表達，，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學機制研究[D];蘇州大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：單克隆抗體藥物及其糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：320821