本文關(guān)鍵詞：NGR肽和CPPs肽協(xié)同介導(dǎo)的超聲脂質(zhì)微泡腫瘤靶向遞送siRNA的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating peptides,CPPs)具有良好的細(xì)胞膜穿透功能,但同時又有明顯的缺點,使其在體內(nèi)的應(yīng)用效果不是很理想。缺點主要有以下兩點:(1)CPPs缺乏組織特異性,可以穿透它所遇到的每個細(xì)胞的細(xì)胞膜;(2)其在血液循環(huán)時易被血液中的酶降解。CPPs的這些缺點使得它在到達靶細(xì)胞之前必須進行功能掩蔽,到達靶細(xì)胞之后再通過內(nèi)部或外部刺激的方式對其進行激活。超聲脂質(zhì)微泡(Ultrasonic Lipid microbubble,ULM)作為一種新型的藥物載體,不僅可以增強超聲顯像效果,還具有靶向治療作用。它作為載體時的主要優(yōu)點有:(1)具有物理化學(xué)靶向性,利用一定強度的超聲在腫瘤靶區(qū)的體表定位輻照,超聲介導(dǎo)微泡的空化效應(yīng)可導(dǎo)致微泡在腫瘤靶組織內(nèi)破裂,微泡所攜帶的藥物會迅速釋放到腫瘤靶區(qū),實現(xiàn)靶向釋藥的目的;(2)提高轉(zhuǎn)染效率,微泡內(nèi)氣體破裂瞬間,會在局部產(chǎn)生很高的能量沖擊,導(dǎo)致靶細(xì)胞膜輕度可逆損害,膜通透性增高,從而對基因藥物攝入增強。因此,我們可以集成超聲脂質(zhì)微泡和CPPs的優(yōu)勢功能,互補互利,保證基因藥物在體內(nèi)獲得高轉(zhuǎn)染效率。本研究的主要內(nèi)容就是構(gòu)建一種全新的多功能集成的基因載體。與現(xiàn)有文獻報道的基因載體不同,本研究采用把CPPs與小干擾RNA(small-interfering RNA,siRNA)以共價物形式包入超聲脂質(zhì)微泡內(nèi)實現(xiàn)對CPPs到達靶細(xì)胞之前的功能掩蔽,在靶部位給予一定功率的超聲輻照,使微泡內(nèi)氣體振蕩、擴大至爆破,一方面可以增高靶細(xì)胞膜的通透性,從而增強靶細(xì)胞對基因藥物的攝入,另一方面可以將超聲脂質(zhì)微泡包載的CPPs暴露出來,實現(xiàn)CPPs的功能激活。本研究工作主要包括以下三部分:(1)功能材料NGR-PEG2000-DSPE和CPPs-siRNA共價物的合成和表征;(2)CPPs-siRNA/NGR-ULM的制備和理化性質(zhì)表征;(3)對所制備的CPPs-siRNA/NGR-ULM進行體外細(xì)胞評價,主要考察CPPs-siRNA/NGR-ULM被HT-1080細(xì)胞的攝取情況、細(xì)胞內(nèi)的分布以及細(xì)胞凋亡狀況。在腫瘤細(xì)胞模型水平對載體的腫瘤靶向和轉(zhuǎn)染效率進行評價。首先,利用siRNA的正義鏈的5’末端巰基和CPPs末端巰基之間的氧化反應(yīng)合成了二硫鍵連接的CPPs-siRNA,采用MALDI-TOF質(zhì)譜確認(rèn)了產(chǎn)物的成功合成。然后采用邁克爾加成反應(yīng)制備了功能材料NGR-PEG2000-DSPE,同樣采用MALDI-TOF質(zhì)譜對合成產(chǎn)物進行了確認(rèn)。再采用薄膜分散/超聲法,通過反復(fù)凍融以及超聲加氣的方法制備了CPPs-siRNA/ULM和CPPs-siRNA/NGR-ULM,并對其理化性質(zhì)進行了表征。結(jié)果顯示,所制備樣品為不規(guī)則多邊形粒子,粒徑約為150 nm,包封率約為85%,24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,且在機械指數(shù)(mechanical index,MI)為0.6的條件下超聲輻照5 min,CPPs-siRNA的釋放度可達80%以上。以人纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080 cells)為模型細(xì)胞,對所制備的CPPs-siRNA/ULM和CPPs-siRNA/NGR-ULM進行了體外細(xì)胞水平的評價。結(jié)果顯示,NGR肽的修飾可以顯著增加CPPs-siRNA/NGR-ULM對CD13高表達的HT-1080細(xì)胞的結(jié)合力。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),超聲激活后的CPPs-siRNA/NGR-ULM進入胞內(nèi)后能夠有效逃逸晚期內(nèi)涵體/溶酶體。且引入的靶向修飾基團和超聲激活處理能夠顯著增強CPPs-siRNA/NGR-ULM的基因沉默效應(yīng),實現(xiàn)了最顯著的腫瘤細(xì)胞凋亡(約54%)。NGR肽、超聲脂質(zhì)微泡以及超聲激活的CPPs的協(xié)同作用,顯著提高了CPPs-siRNA/NGR-ULM超聲激活組被HT-1080細(xì)胞的攝取率及對HT-1080細(xì)胞的增殖抑制效果。基于上述結(jié)果,NGR肽和可超聲激活CPPs協(xié)同作用的超聲脂質(zhì)微泡作為一種新型多功能集成載體,顯示了較理想的細(xì)胞抗腫瘤效果,為惡性腫瘤靶向治療研究領(lǐng)域開辟了新途徑。
【關(guān)鍵詞】：超聲脂質(zhì)微泡 NGR靶頭 細(xì)胞穿透肽 小干擾RNA c-myc基因
【學(xué)位授予單位】：湖北科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-12
• 第一部分 功能材料的合成12-16
• 1 儀器和材料12-13
• 2 實驗方法13
• 3 實驗結(jié)果13-14
• 4 討論14-15
• 5 小結(jié)15-16
• 第二部分CPPs-si RNA/NGR-ULM的制備和表征16-26
• 1 儀器和材料16-17
• 2 實驗方法17-19
• 3 實驗結(jié)果19-24
• 4 討論24-25
• 5 小結(jié)25-26
• 第三部分CPPs-si RNA/NGR-ULM的體外細(xì)胞評價26-36
• 1 儀器和材料26-27
• 2 實驗方法27-29
• 3 實驗結(jié)果29-34
• 4 討論34
• 5 小結(jié)34-36
• 參考文獻36-39
• 文獻綜述39-53
• 參考文獻48-53
• 攻讀學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果53-54
• 致謝54

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本文編號：315835