本文關(guān)鍵詞：以中鏈脂肪酸受體GPR84為靶點(diǎn)的藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)是C9-C14的中鏈脂肪酸受體,不僅在脂肪酸代謝和機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用,而且與腸炎、多發(fā)性硬化癥、內(nèi)毒素血癥等炎癥性免疫疾病有著密切聯(lián)系。由于GPR84是一種促進(jìn)炎癥發(fā)生的受體,因此,找到以GPR84為靶點(diǎn)的拮抗劑,可能為治療這些疾病提供一種有效的方法。迄今為止針對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體常用的藥物篩選方法有兩種,一種是針對(duì)受體的配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn),另外一種是依賴于GPCR下游信號(hào)通路(如cAMP, Ca2+)的功能性實(shí)驗(yàn)。在GPCR激活后,可以活化Gαq亞基中的Gα16,通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后,可以升高胞內(nèi)肌醇三磷酸(IP3)的濃度,繼而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子釋放,通過(guò)檢測(cè)胞質(zhì)中鈣離子濃度的變化,可以推斷出受體被激活的水平。本文將含GPR84和Gα16基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)抗生素抗性篩選,挑取穩(wěn)定表達(dá)GPR84蛋白的HEK293細(xì)胞系。用RT-PCR、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了GPR84基因和其編碼受體蛋白的表達(dá)；用鈣流實(shí)驗(yàn)、cAMP實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)、FACS實(shí)驗(yàn)證實(shí)了表達(dá)的GPR84具有完整的生物學(xué)活性,并利用該細(xì)胞系進(jìn)行了藥物高通量篩,得到了新的GPR84拮抗劑,為進(jìn)一步闡明GPR84的生物學(xué)功能,研究并治療與其相關(guān)免疫疾病奠定了基礎(chǔ)。建立HEK293/GPR84/ Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。方法：將編碼GPR84和Gα16蛋白的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至HEK293細(xì)胞之中,利用抗生素抗性篩選28天,選擇穩(wěn)定生長(zhǎng)的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),得到單克隆之后,利用RT-PCR和免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了外源基因和表達(dá)的受體蛋白,結(jié)果：RT-PCR和免疫熒光染色均檢測(cè)到GPR84蛋白的表達(dá),證明獲得的細(xì)胞系膜表面穩(wěn)定表達(dá)GPR84受體。檢測(cè)獲得的HEK293/GPR84/Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系上GPR84活性及功能。方法：利用鈣流實(shí)驗(yàn)、cAMP實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)GPR84的配體6-OAU對(duì)本細(xì)胞株上穩(wěn)定表達(dá)的GPR84具有激動(dòng)作用；利用鈣流實(shí)驗(yàn)、FACS實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在6-OAU刺激后,本細(xì)胞株膜表面上的GPR84受體脫敏,并發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象。結(jié)果：GPR84能被6-OAU呈劑量依賴性地激活,說(shuō)明建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系膜表面上的GPR84具有完整的生物學(xué)功能。建立高通量鈣流篩選模型及其應(yīng)用。方法：(1)高通量鈣流模型分為兩種模型：激動(dòng)劑模型及拮抗劑模型,即可分別評(píng)價(jià)6-OAU和小分子化合物對(duì)GPR84受體的作用；(2)應(yīng)用拮抗劑模型檢測(cè)了國(guó)家化合物樣品庫(kù)中的一系列化合物對(duì)GPR84的作用。結(jié)果：6-OAU能劑量依賴地激活趨化因子受體GPR84,在激動(dòng)劑模型中檢測(cè)到顯著的鈣離子變化信號(hào),而應(yīng)用拮抗劑模型,篩選小分子化合物能否抑制6-OAU引起的鈣離子變化,初步得到了對(duì)趨化因子受體GPR84有一定拮抗作用的化合物ZQ-02,并驗(yàn)證了該化合物對(duì)GPR84的拮抗活性和特異性。
【關(guān)鍵詞】：GPR84 G蛋白偶聯(lián)受體 穩(wěn)定表達(dá) 拮抗劑 鈣流實(shí)驗(yàn) 高通量篩
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 G蛋白偶聯(lián)受體12-16
• 1.1.1 GPCRs的結(jié)構(gòu)與分類12-13
• 1.1.2 基于GPCRs的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)13-16
• 1.1.3 以G蛋白偶聯(lián)受體為靶點(diǎn)的藥物開發(fā)以及市場(chǎng)前景16
• 1.2 中鏈脂肪酸受體GPR84概述16-21
• 1.2.1 游離脂肪酸受體及其分類16-17
• 1.2.2 GPR84的功能及其配體17-19
• 1.2.3 GPR84與疾病19-21
• 第二章 研究目的與內(nèi)容21-23
• 2.1 研究目的21
• 2.2 研究?jī)?nèi)容21-23
• 第三章 材料與方法23-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料23-30
• 3.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株23
• 3.1.2 試劑及耗材23-24
• 3.1.3 儀器24-26
• 3.1.4 試劑配制26-30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 3.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建30
• 3.2.2 RT-PCR30-31
• 3.2.3 鈣流實(shí)驗(yàn)31
• 3.2.4 環(huán)腺苷酸(cAMP)實(shí)驗(yàn)31-32
• 3.2.5 免疫熒光染色32
• 3.2.6 流式細(xì)胞分析(FACS)32
• 3.2.7 Western blot檢測(cè)ERK磷酸化水平32-33
• 3.2.8 GPR84拮抗劑的高通量篩選33-34
• 3.2.9 數(shù)據(jù)處理及分析34-35
• 第四章 結(jié)果與分析35-44
• 4.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GPR84/Gα16蛋白的HEK293細(xì)胞株35
• 4.2 GPR84基因表達(dá)及其受體蛋白定位35-36
• 4.3 6-OAU提高GPR84介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)濃度36
• 4.4 6-OAU通過(guò)GPR84降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平36-37
• 4.5 6-OAU通過(guò)激活GPR84導(dǎo)致ERK磷酸化37-38
• 4.6 6-OAU誘導(dǎo)GPR84發(fā)生脫敏現(xiàn)象38-39
• 4.7 6-OAU誘導(dǎo)GPR84發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象39-40
• 4.8 GPR84拮抗劑的高通量篩選(初篩)40-41
• 4.9 GPR84拮抗劑的復(fù)篩及其活性驗(yàn)證41-44
• 第五章 結(jié)論及意義44-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 在學(xué)期間所取得的科研成果49-50
• 致謝50

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6 孟鵬;齊西珍;鄭芳;任麗梅;白芳;白鋼;;α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型的建立及其應(yīng)用[J];微生物學(xué)報(bào);2010年08期

7 唐先兵,司書毅,張?jiān)虑?以大腸埃希氏菌肽脫甲酰基酶為靶點(diǎn)的高通量篩選模型的建立(英文)[J];中國(guó)抗生素雜志;2003年10期

8 柳軍;牛蕤;張陸勇;;糖原磷酸化酶抑制劑高通量篩選模型的建立[J];中國(guó)新藥雜志;2007年06期

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4 趙遠(yuǎn)勝;人源DPPIV抑制劑高通量篩選模型的建立和新型抑制劑的發(fā)現(xiàn)[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2005年

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6 步洪強(qiáng);結(jié)核分枝桿菌DXS和DXR抑制劑高通量篩選模型的建立與應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 張慶;以中鏈脂肪酸受體GPR84為靶點(diǎn)的藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用[D];華東師范大學(xué);2015年

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