本文關(guān)鍵詞：2-吡咯烷酮衍生物HL-5201促人HepG-2細(xì)胞增殖和抗凋亡作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的：我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2-吡咯烷酮衍生物HL-5201[N-(2-吡啶基)-4-環(huán)己氨基-5-氧代-2,5-二氫-3-吡咯甲酸乙酯],體外對多種細(xì)胞具有明顯的促增殖或促代謝活力作用,體內(nèi)能夠促進(jìn)S180荷瘤小鼠腫瘤的生長,對原核表達(dá)系統(tǒng)制備的Caspase-3酶具有抑制活性。本論文擬通過研究2-吡咯烷酮衍生物HL-5201對人HepG-2增殖及凋亡的影響探討該類化合物的促細(xì)胞增殖作用機(jī)制。其最終目的是闡明該類化合物的作用靶點(diǎn),利用該靶點(diǎn)可開發(fā)抗腫瘤藥物,或開發(fā)治療代謝緩慢等相關(guān)疾病的藥物,并為該類藥物的安全使用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法：本研究采用MTT法檢測了HL-5201體外對多種細(xì)胞株的促增殖作用,包括人HepG-2、人Hela、人EC 109、人MDA-MB-231、人HGC-27、人PC-3、小鼠RAW 264.7、小鼠脾細(xì)胞、小鼠BV-2、小鼠C 17.2及大鼠PC-12細(xì)胞株；觀察HL-5201對幼齡小鼠體重的影響,研究HL-5201是否影響生長發(fā)育；MTT比色法探討不同時(shí)間和不同濃度HL-5201對人HepG-2增殖及凋亡的影響；倒置顯微鏡觀察藥物作用后人HepG-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；DAPI染色后熒光顯微鏡觀察藥物作用后人HepG-2細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化。利用PI染色流式細(xì)胞儀觀察藥物作用后人HepG-2細(xì)胞周期分布的變化；應(yīng)用JC-1染色法檢測藥物作用后細(xì)胞線粒體膜電位的變化。使用Western blotting免疫印跡分析方法和Caspase-3,-9酶活性檢測試劑盒方法檢測藥物作用后細(xì)胞增殖和凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)及酶活性表達(dá)的變化；借助通道抑制劑初步探討HL-5201作用環(huán)節(jié)；通過MTT比色法檢測HL-5201結(jié)構(gòu)類似物對人HepG-2增殖和凋亡活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1)HL-5201對人HepG-2、人Hela、人EC109有明顯的促增殖作用,但不同細(xì)胞作用強(qiáng)度不同；對人HGC-27、人PC-3.小鼠C 17.2及大鼠PC-12表現(xiàn)為抑制增殖的作用,且其抑制作用具有濃度依賴性,HL-5201的濃度越大,抑制增殖的活性越強(qiáng)；而對于人MDA-MB-231、小鼠脾細(xì)胞、小鼠RAW 264.7、小鼠BV-2則表現(xiàn)為雙向作用,在濃度較高時(shí),表現(xiàn)為抑制增殖作用,低濃度時(shí)則表現(xiàn)為促進(jìn)增殖的活性。2)HL-5201對幼齡小鼠各階段體質(zhì)量增重影響的結(jié)果顯示,HL-5201僅在第1-5 d,以50 mg/kg劑量灌胃給藥時(shí)能提高小鼠的平均日增重,增重率為7.8%,與空白對照組比較有顯著性差異(P=0.016),其余劑量與時(shí)間段對小鼠的平均日增重均無影響(P0.05)。3)HL-5201對人HepG-2細(xì)胞株具有明顯的促進(jìn)增殖作用及拮抗MMC的細(xì)胞毒作用,且促增殖和拮抗作用的最適作用濃度為45μmol/L,最適作用時(shí)間為72 h。4)倒置顯微鏡下我們觀察到空白對照組以及HL-5201組的細(xì)胞生長狀況良好,細(xì)胞伸展呈梭型及多角形,細(xì)胞透亮,生長旺盛。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后,HL-5201組的細(xì)胞數(shù)量要比空白對照組多,說明HL-5201具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。而人HepG-2經(jīng)絲裂霉素C (MMC)作用之后,倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞變圓,貼壁不牢固,有大量漂浮細(xì)胞,生長受到明顯的抑制等現(xiàn)象。MMC+HL-5201組在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長狀況明顯改善。經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后,MMC+HL-5201組細(xì)胞的總數(shù)明顯比MMC模型組多,而凋亡細(xì)胞數(shù)量比MMC組少。說明HL-5201能夠抑制MMC對人HepG-2誘導(dǎo)凋亡的作用。5)經(jīng)DAPI染色后,在熒光顯微鏡下可觀察到空白對照組和HL-5201組的細(xì)胞核形態(tài)呈圓形,邊緣清晰,染色均勻呈淡藍(lán)色,細(xì)胞成片生長。HL-5201組的完整細(xì)胞核的數(shù)量明顯多于空白對照組。MMC模型組經(jīng)DAPI染色后,從熒光強(qiáng)度以及核形態(tài)可以鑒別出細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型特征——細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)致密呈斑塊狀濃集于核膜下,可見明顯的凋亡小體。MMC和HL-5201共同作用于人HepG-2,在熒光顯微鏡下雖然也能觀察到很多凋亡小體,但MMC+HL-5201組完整細(xì)胞核的數(shù)量明顯多于MMC凋亡組,而凋亡小體則明顯少于MMC凋亡組。由此說明HL-5201能夠通過促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抑制細(xì)胞凋亡的途徑以達(dá)到增加細(xì)胞數(shù)量,延長生存時(shí)間的目的。6)我們通過PI染色流式細(xì)胞儀觀察,發(fā)現(xiàn)HL-5201作用于人HepG-2細(xì)胞株后,其對細(xì)胞周期分布的影響不明顯,只觀察到與MMC模型組比較,MMC+HL-5201組的亞二倍體細(xì)胞數(shù)(凋亡細(xì)胞)下降4.7%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045),其余相同細(xì)胞周期的細(xì)胞百分率兩兩比較,均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7)從JC-1染色結(jié)果中我們可以觀察到MMC組的HepG-2細(xì)胞經(jīng)MMC作用之后線粒體膜電位下降,并且與空白對照組相比有顯著性差異(P=0.000)。而經(jīng)HL-5201作用后,我們可發(fā)現(xiàn)HL-5201除了能穩(wěn)定正常的線粒體膜電位之外,還能穩(wěn)定被MMC損傷的線粒體膜電位,提示其可抑制線粒體凋亡途徑的開啟,從而關(guān)閉后續(xù)的凋亡反應(yīng)。8) Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,HL-5201組的Phospho-Akt(Ser 473)、Phospho-Bcl-2(Ser 70)、Phospho-Bad(Ser 112)蛋白的含量明顯增加,Bad、Bax的表達(dá)則明顯減少,對Akt、Bcl-2以及線粒體內(nèi)部的Cytochrome C蛋白表達(dá)無明顯影響。而當(dāng)HL-5201與MMC合用后,與MMC模型組相比,HL-5201亦能明顯上調(diào)Phospho-Akt(Ser 473)、 Phospho-Bcl-2(Ser 70)、Phospho-Bad(Ser 112)的水平,下調(diào)Bad、Bax的表達(dá),以及將Cytochrome C蛋白穩(wěn)定在線粒體內(nèi)部。因此可以認(rèn)為HL-5201通過調(diào)節(jié)上述蛋白基因的表達(dá)以及磷酸化,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖分裂并拮抗MMC對人HepG-2細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡作用。9) Caspase-3和Caspase-9活性檢測結(jié)果顯示,MMC明顯提高兩者的活性,HL-5201作用于MMC誘導(dǎo)的HepG-2凋亡模型后,Caspase-9的活性由9.55U下調(diào)為7.12 U,有顯著性差異(P=0.000),Caspase-3的的活性由8.64 U,下調(diào)為6.59 U,有顯著性差異(P=0.009)。提示HL-5201可能通過抑制Caspase-3酶原及Caspase-9酶原的活化,進(jìn)而抑制MMC誘導(dǎo)人HepG-2細(xì)胞的凋亡。10)MTT比色法檢測信號(hào)通路阻斷劑、蛋白酶或基因轉(zhuǎn)錄抑制劑對HL-5201作用于人HepG-2代謝活力變化的結(jié)果顯示,與空白對照組相比,HL-5201對人HepG-2細(xì)胞的代謝活力或增殖具有明顯的促進(jìn)作用(P=0.000)。酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein、PI3K抑制劑LY 294002和Wortmannin、PKA抑制劑H 89. MAPKK抑制劑PD 98059和U 0126、p38 MAPK抑制劑SB203580、JAK-2抑制劑AG 490、JNK抑制劑SP 600125、蛋白酶體抑制劑MG 132、基因轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D均能明顯抑制HL-5201促進(jìn)HepG-2細(xì)胞代謝活力,與HL-5201組比較均有顯著性差異(P值均等于0.000)；而NF-κB抑制劑BAY 11-7082對HL-5201促進(jìn)HepG-2細(xì)胞代謝活力無影響(P=0.220)。11)MTT比色檢測HL-5201(5s)結(jié)構(gòu)類似物對HepG-2增殖代謝活力及拮抗MMC細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HL-5201(5s)、5b、5m、5n四個(gè)化合物對人HepG-2具有促增殖作用,但作用強(qiáng)度有差異。其中,4個(gè)化合物中5b在濃度為90μmol/L時(shí)對HepG-2促增殖效果最好,增殖率為44.91%。5n在濃度為60μmol/L對HepG-2促增殖作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但增殖效應(yīng)僅為3.36%。5s、5b、5m對MMC所致人HepG-2的細(xì)胞毒性作用具有不同程度的拮抗作用。其中45 p.mol/L的HL-5201(5s)對MMC的拮抗作用最好,達(dá)19.81%；5b僅濃度為90μmol/L具有拮抗MMC的作用,當(dāng)5b濃度下降到60μmol/L或以下,不僅拮抗效應(yīng)消失,同時(shí)還能與MMC產(chǎn)生協(xié)同作用,促進(jìn)HepG-2死亡。5n不具有拮抗MMC的作用。結(jié)論：1)HL-5201體外對不同的細(xì)胞表現(xiàn)的作用效果不同,有些表現(xiàn)為促進(jìn)增殖,有些表現(xiàn)為抑制增殖,還有一些呈現(xiàn)雙向作用,高濃度抑制,低濃度促進(jìn)。2)HL-5201體外促細(xì)胞增殖作用具有選擇性,不同細(xì)胞對HL-5201的敏感性不同。3)HL-5201對幼齡小鼠早期的生長有促進(jìn)作用,但不會(huì)影響最終的發(fā)育與成熟。4)HL-5201能夠促進(jìn)人HepG-2細(xì)胞的增殖,同時(shí)能抑制MMC誘導(dǎo)人HepG-2細(xì)胞凋亡的作用。5)HL-5201(5s)的結(jié)構(gòu)類似物體外對人HepG-2也具有促增殖和抑凋亡的活性,其活性受取代基的影響。6)綜合分析所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HL-5201的作用靶點(diǎn)在PI3K/ Akt信號(hào)通路中Akt的上游。其作用機(jī)制可能是：通過激活酪氨酸激酶、PBK/ Akt和MAPK等信號(hào)通路,激活蛋白酶體,促進(jìn)有關(guān)蛋白磷酸化,從而增強(qiáng)細(xì)胞的代謝能力和增殖能力,同時(shí)還能夠通過阻礙線粒體凋亡途徑的開啟,解除MMC對細(xì)胞G2期的阻滯而抑制凋亡。
【關(guān)鍵詞】：2-吡咯烷酮類衍生物 HL-5201 細(xì)胞增殖 抗凋亡 作用機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 前言16-24
• 參考文獻(xiàn)21-24
• 第二章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201對細(xì)胞代謝活力/增殖及小鼠體重的影響24-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 3 統(tǒng)計(jì)分析27
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 5 討論29-31
• 6 結(jié)論31
• 7 參考文獻(xiàn)31-32
• 第三章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201對人HepG-2細(xì)胞促增殖及抗凋亡作用32-72
• 1 實(shí)驗(yàn)材料32-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-45
• 3 統(tǒng)計(jì)分析45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-57
• 5 討論57-66
• 6 結(jié)論66
• 7 參考文獻(xiàn)66-72
• 第四章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201(5s)、5b、5m、5n對人HepG-2增殖的影響72-81
• 1 實(shí)驗(yàn)材料72-75
• 2 實(shí)驗(yàn)方法75
• 3 統(tǒng)計(jì)分析75-76
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-78
• 5 討論78-80
• 6 結(jié)論80
• 7 參考文獻(xiàn)80-81
• 附錄81-84
• 攻讀學(xué)位期間成果84-85
• 致謝85-86

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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  本文關(guān)鍵詞：2-吡咯烷酮衍生物HL-5201促人HepG-2細(xì)胞增殖和抗凋亡作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：301019