本文關(guān)鍵詞：繡球菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及其多糖神經(jīng)保護研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：繡球菌(Sparassis Crispa)是一種珍貴的藥食兩用真菌,具有提高免疫力、抗腫瘤、抗高血壓、抗糖尿病等多種藥理活性。繡球菌的有效成分主要有蛋白質(zhì)、多糖、麥角固醇、葡糖苷酰鞘氨醇、腺苷和其他一些小分子化合物等。市場中的繡球菌產(chǎn)品非常少且昂貴,培養(yǎng)難度高,難以滿足繡球菌的市場需求。在微生物工程方面,繡球菌發(fā)酵并不成熟,急需提高菌株的產(chǎn)量及有效成分的含量。同時在藥理活性方面,繡球菌胞內(nèi)多糖的活性也是人們關(guān)注的焦點。本文主要針對繡球菌在工業(yè)生產(chǎn)中存在的培養(yǎng)技術(shù)不成熟的問題及其藥理活性進行了研究。采用亞硝基胍誘變的方法對繡球菌進行改良,以菌絲體干重為指標對突變株進行篩選,得到高產(chǎn)菌株SC031,干重是原始菌株的1.6倍。采用化學(xué)計量學(xué)的方法對該菌最佳的搖瓶培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。最終確定繡球菌高產(chǎn)菌株SC031的最佳培養(yǎng)基配方:蔗糖30.67 g/L、酵母浸粉10.88 g/L、蛋白胨10 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1.59 g/L和維生素B1 0.10 g/L。對繡球菌高產(chǎn)菌株SC031的胞內(nèi)多糖進行分離純化獲得SCWEA和SCWEB兩個純化胞內(nèi)多糖組分。并采用HPLC色譜、動態(tài)光散射、紫外光譜、紅外光譜及高碘酸氧化和Smith降解對其進行初步的結(jié)構(gòu)分析。SCWEA和SCWEB的平均分子量和粒徑大小分別為75和184 kDa,88.9 nm和1012.2 nm。SCWEA的單糖組成:鼠李糖、甘露糖和少量的半乳糖。SCWEB則由葡萄糖和極少量的阿拉伯糖組成。SCWEA和SCWEB組分中不存在核酸和蛋白質(zhì),含有·OH、C-H、C-O-C、C-O-H和強弱不同的C=O。在SCWEA中一定含有1→3糖苷鍵和1→6糖苷鍵,不存在1→4糖苷鍵,可能存在1→2糖苷鍵。其中1→3糖苷鍵在主鏈上而1→6糖苷鍵在側(cè)鏈上。SCWEB主體很可能為為1,3β-葡聚糖。最后本文采用谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型來研究繡球菌高產(chǎn)菌株SC031的純化多糖SCWEA和SCWEB的保護作用及其作用分子機制。采用MTT方法檢測細胞凋亡的比例;Fluo-4-AM熒光染色法檢測鈣離子含量;JC-1熒光探針法分析細胞內(nèi)線粒體膜電位的變化;DCFH-DA熒光染色法檢測活性氧的積累;Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-x L、Akt、GSK等的表達。結(jié)果顯示,SCWEA和SCWEB均可顯著降低神經(jīng)毒素所誘發(fā)的細胞凋亡率,可抑制神經(jīng)毒素所致的細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加,減少線粒體膜電位的降低,緩解神經(jīng)毒素誘發(fā)PC12細胞胞內(nèi)ROS的過量積聚,并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗凋亡蛋白的表達,可以通過線粒體的依賴途徑及Akt/GSK通路修復(fù)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷。為神經(jīng)損傷類疾病的治療提供了新思路,為新的抗神經(jīng)退行性疾病制劑提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：繡球菌 選育 發(fā)酵 胞內(nèi)多糖 純化 神經(jīng)保護
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 緒論13-18
• 1.1 繡球菌概述13
• 1.1.1 繡球菌的生物活性成分13
• 1.1.2 繡球菌的藥理學(xué)活性13
• 1.2 微生物發(fā)酵工程13-15
• 1.2.1 誘變選育13-14
• 1.2.2 微生物發(fā)酵優(yōu)化方法14-15
• 1.3 神經(jīng)退行性疾病15-17
• 1.3.1 神經(jīng)元損傷模型16
• 1.3.2 細胞凋亡機制16-17
• 1.4 立題背景和研究意義17-18
• 第二章 繡球菌高產(chǎn)菌株的誘變選育與搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化18-31
• 2.1 引言18
• 2.2 材料與儀器18-19
• 2.2.1 菌株18
• 2.2.2 儀器設(shè)備18-19
• 2.2.3 試劑19
• 2.2.4 培養(yǎng)基19
• 2.3 實驗方法19-23
• 2.3.1 培養(yǎng)方法19
• 2.3.2 誘變選育與目的菌株的篩選19-20
• 2.3.3 有效成分提取及含量測定方法20
• 2.3.4 滿意度函數(shù)的建立20-21
• 2.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化21-23
• 2.4 結(jié)果與討論23-29
• 2.4.1 誘變選育23
• 2.4.2 繡球菌高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基優(yōu)化23-29
• 2.5 本章小結(jié)29-31
• 第三章 繡球菌高產(chǎn)菌株SC031胞內(nèi)多糖的分離純化及初步結(jié)構(gòu)分析31-40
• 3.1 引言31-32
• 3.2 材料與儀器32
• 3.2.1 菌株32
• 3.2.2 儀器設(shè)備32
• 3.2.3 試劑32
• 3.2.4 培養(yǎng)基32
• 3.3 實驗方法32-34
• 3.3.1 SC031菌絲體的制備32-33
• 3.3.2 SC031胞內(nèi)粗多糖的制備33
• 3.3.3 SC031胞內(nèi)多糖的純化33
• 3.3.4 SCWE粒徑和分子量的測定33
• 3.3.5 SCWE的單糖組分分析33
• 3.3.6 SCWE紫外光譜檢測33-34
• 3.3.7 SCWE紅外光譜分析34
• 3.3.8 SCWE高碘酸氧化和Smith降解34
• 3.4 結(jié)果與討論34-39
• 3.4.1 SC031胞內(nèi)多糖的DEAE?52纖維素柱層析34-36
• 3.4.3 SC031胞內(nèi)多糖的Sephadex G100柱層析36
• 3.4.4 SCWE分子量粒徑及單糖組成分析36
• 3.4.5 SCWE紫外光譜檢測36-37
• 3.4.6 SCWE的FTIR光譜分析37-38
• 3.4.7 SCWE的高碘酸氧化和Smith降解38-39
• 3.5 本章小結(jié)39-40
• 第四章 繡球菌純化多糖神經(jīng)保護活性及相關(guān)機制40-50
• 4.1 引言40
• 4.2 材料與儀器40-41
• 4.2.1 主要儀器40
• 4.2.2 試劑40-41
• 4.2.3 實驗細胞41
• 4.3 實驗方法41-43
• 4.3.1 PC12細胞的培養(yǎng)41
• 4.3.2 細胞活性測定41
• 4.3.3 細胞凋亡形態(tài)分析41-42
• 4.3.4 活性氧簇（ROS）活性測定42
• 4.3.5 細胞內(nèi)鈣離子濃度分析42
• 4.3.6 細胞線粒體膜通透測定42
• 4.3.7 Western blotting技術(shù)42-43
• 4.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法43
• 4.4 實驗結(jié)果與討論43-48
• 4.4.1 SCWEA和SCWEB對L-谷氨酸誘導(dǎo)凋亡的PC12細胞存活率的影響43-44
• 4.4.2 SCWEA和SCWEB對L-谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流及ROS濃度的影響44-45
• 4.4.3 SCWEA和SCWEB對L-谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞線粒體功能的影響45-47
• 4.4.4 SCWEA和SCWEB對L-谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型中Akt和GSK表達的影響47-48
• 4.5 本章小結(jié)48-50
• 第五章 全文研究成果與展望50-52
• 5.1 主要研究成果50-51
• 5.2 后續(xù)工作展望51-52
• 參考文獻52-59
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果59-61
• 致謝61

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  本文關(guān)鍵詞：繡球菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及其多糖神經(jīng)保護研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：300198