發(fā)布時(shí)間：2017-04-11 20:23

  本文關(guān)鍵詞：脊髓背角Paxillin對痛覺突觸傳遞的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：Paxillin是一種包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的信號連接蛋白。通過與黏著斑激酶(FAK)、Src家族酪氨酸激酶(SFKs)、C-末端Src激酶(CSK)等相結(jié)合,Paxillin密切調(diào)控著細(xì)胞粘附過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),Paxillin也表達(dá)于興奮性谷氨酸能突觸中,但Paxillin的突觸功能及其病理意義目前尚不清楚。本文在痛覺調(diào)控的關(guān)鍵部位---脊髓背角,探討了Paxillin對痛覺突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。方法：本文建立完全弗氏佐劑(CFA)誘發(fā)的慢性炎性疼痛模型,結(jié)合行為學(xué)、免疫共沉淀、免疫組織化學(xué)、場電位記錄等方法,從Paxillin的突觸定位、蛋白相互作用、信號傳導(dǎo)等角度,研究了Paxillin在痛覺可塑性變化中的作用。結(jié)果：(1)Paxillin主要分布于脊髓背角神經(jīng)元,且存在于突觸后致密質(zhì)(postsynaptic density; PSD)中；(2)免疫組化結(jié)果顯示：突觸活動(synapticactivity)能夠動態(tài)調(diào)節(jié)Paxillin第118位酪氨酸殘基(Paxillin-Yl 18)的磷酸化水平；當(dāng)使用GABAA受體阻斷劑bicuculline(100μM)處理離體脊髓片、以提高神經(jīng)突觸活動之后,Paxillin-Y118的磷酸化水平會明顯降低,而這一作用可被N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑D-APV(100μM)所阻斷；與bicuculline相似,外周組織損傷也能引發(fā)脊髓背角Paxillin-Y118的去磷酸化；(3)為直接探討Paxillin-Y118磷酸化改變的意義,我們構(gòu)建了Paxillin(Y118E)和Paxillin(Y118F)兩種突變體,以分別模擬Y118的磷酸化和去磷酸化,并通過重組腺病毒載體、使脊髓背角神經(jīng)元過表達(dá)外源性Paxillin突變體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Paxillin(Y118F)能夠在正常動物誘發(fā)明顯的痛覺超敏,增大脊髓背角C-纖維誘發(fā)場電位長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的幅度；而脊髓過表達(dá)Paxillin(Y118E)對正常動物的痛閾無明顯影響,但卻能降低LTP的幅度,提示：Paxillin-Y118的磷酸化水平密切調(diào)控脊髓敏感化過程；(4)Paxillin的痛覺調(diào)控作用,與SFKs以及NMDA受體有關(guān)；我們發(fā)現(xiàn)：Paxillin(Y118F)能夠增強(qiáng)Src活性,促進(jìn)Src對NMDA受體GluN2B亞基第1472位酪氨酸殘基(GluN2B-Y1472)的磷酸化；鞘內(nèi)注射SFKs抑制劑PP2(1.5μg)能夠有效抑制Paxillin(Y118F)引起的痛覺超敏；(5)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都顯示：Paxillin-Y118的去磷酸化,會打斷Paxillin與Src的抑制蛋白CSK之間的相互作用,降低CSK的突觸表達(dá)水平,這可能是Paxillin(Y118F)誘發(fā)Src依賴性GluN2B功能亢進(jìn)的重要機(jī)制；(6)為驗(yàn)證這一假設(shè),我們構(gòu)建了野生型CSK[CSK(WT)]和無活性的CSK突變體CSK(K222R),并通過腺病毒表達(dá)載體、感染脊髓背角神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)：正常動物表達(dá)CSK(K222R)也能夠誘發(fā)明顯的痛覺超敏,且這一作用可被GluN2B的選擇性抑制劑ifenprodil (1.6μg)所阻斷；(7)為探討Paxillin在慢性炎性疼痛中的作用,我們使炎性疼痛動物過表達(dá)Paxillin(Y118E),發(fā)現(xiàn)：Paxillin(Y118E)能夠重新升高CSK的突觸表達(dá)水平,有效緩解慢性炎性疼痛癥狀。結(jié)論：外周組織損傷可引發(fā)Paxillin-Y118去磷酸化,打斷Paxillin和CSK的分子結(jié)合,降低CSK的突觸含量,從而解除CSK對Src的抑制性控制,導(dǎo)致Src的活化及其對GluN2B-Y1472的磷酸化；過表達(dá)Paxillin(Y118E)能夠重新升高CSK的突觸表達(dá)水平,有效緩解慢性炎性疼痛癥狀。
【關(guān)鍵詞】：炎性疼痛 脊髓背角 N-甲基-D-天冬氨酸受體 Paxillin C-末端 Src激酶 Src
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 Paxillin的結(jié)構(gòu)與功能11-12
• 1.2 NMDA受體與突觸可塑性12-14
• 1.3 Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinases)14-15
• 1.4 C-末端Src激酶(C-terminal Src kinase；CSK)15-17
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法17-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材17-18
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑18-20
• 2.1.4 溶液配制20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.2.1 皮下給藥21-22
• 2.2.2 鞘內(nèi)給藥22
• 2.2.3 行為學(xué)測試22
• 2.2.4 小鼠脊髓背角亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離22-23
• 2.2.5 HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染23
• 2.2.6 免疫蛋白印跡(Western Blot)23-24
• 2.2.7 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation;Co-IP)24-25
• 2.2.8 免疫組化(Immunohistochemistry;IHC)25
• 2.2.9 脊髓背角C-纖維誘發(fā)場電位的記錄(C-fiber evoked field potential recordings)25-26
• 2.2.10 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)(Data analysis and statistics)26-27
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-46
• 3.1 Paxillin在脊髓背角中的分布特征27-28
• 3.1.1 Paxillin分布于脊髓背角神經(jīng)元27
• 3.1.2 Paxillin存在于脊髓背角神經(jīng)元的突觸后致密質(zhì)(PSD)中27-28
• 3.2 突觸活動和外周組織損傷調(diào)節(jié)Paxillin-Y118的磷酸化28-31
• 3.2.1 突觸活動調(diào)節(jié)Paxillin-Y118磷酸化28-30
• 3.2.2 外周組織損傷下調(diào)Paxillin-Y118磷酸化30-31
• 3.3 Paxillin-Y118磷酸化的改變在痛覺傳導(dǎo)中的作用31-33
• 3.3.1 Paxillin-Y118磷酸化的改變在痛覺超敏中的作用31-32
• 3.3.2 Paxillin-Y118磷酸化的改變影響C-纖維誘發(fā)場電位LTP幅度32-33
• 3.4 Paxillin通過SFKs及GluN2B受體調(diào)控痛覺傳遞33-37
• 3.4.1 Paxillin通過SFKs信號通路調(diào)節(jié)痛覺傳遞33-36
• 3.4.2 Paxillin-Y118去磷酸化增強(qiáng)GluN2B-Y1472的磷酸化36-37
• 3.5 Paxillin-Y118磷酸化調(diào)控Paxillin/CSK的結(jié)合及CSK突觸表達(dá)37-42
• 3.5.1 CSK在脊髓背角中的分布37-38
• 3.5.2 Paxillin-Y118去磷酸化降低Paxillin/CSK的分子結(jié)合38-41
• 3.5.3 Paxillin-Y118去磷酸化降低CSK的突觸表達(dá)41-42
• 3.6 CSK的痛覺調(diào)控作用42-43
• 3.7 Paxillin在慢性炎性疼痛中的作用43-46
• 3.7.1 Paxillin(Y118E)增加炎性動物CSK突觸表達(dá)水平43-44
• 3.7.2 Paxillin(Y118E)緩解慢性炎性疼痛癥狀44-46
• 第四章 討論46-52
• 4.1 NMDA受體在調(diào)節(jié)脊髓背角Paxillin-Y118磷酸化中的作用46-47
• 4.2 Paxillin-Y118去磷酸化可降低Paxillin/CSK的分子結(jié)合,降低CSK的突觸表達(dá),調(diào)控痛覺傳遞47-48
• 4.3 Paxillin調(diào)節(jié)痛覺傳遞和突觸可塑性48-51
• 4.4 CSK的痛覺調(diào)控功能51-52
• 第五章 結(jié)論與展望52-53
• 5.1 結(jié)論52
• 5.2 展望52-53
• 縮略詞53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 在學(xué)期間研究成果61-62
• 致謝62

【相似文獻(xiàn)】

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1 龔良維,丁玉強(qiáng),呂巖,鄭恒興,秦秉志,李繼碩;代謝型谷氨酸受體五種亞型在貓脊髓內(nèi)的分布—免疫組織化學(xué)方法研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;1998年01期

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4 龍雙漣,李朗,孫俊,傅希s，

本文編號：299907