本文關(guān)鍵詞：重組人纖溶酶原激活劑（rhPA）轉(zhuǎn)基因兔純合子的篩選及表達特性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血栓性疾病是一類嚴重危害人類健康和生命的疾病,可累及全身各個器官及系統(tǒng),目前利用溶栓藥物成為治療此類疾病的主要方法。溶栓藥物經(jīng)過不斷研究已發(fā)展到第三代,其中以重組人纖溶酶原激活劑(r-tPA)作為治療人類血栓性疾病的新型藥物。重組人組織纖溶酶原激活劑與天然t-PA具有相似的生物學(xué)活性,更具有溶栓能力強、與纖維蛋白親和力高、全身出血副作用小、半衰期長、總使用劑量少等特點。作為第三代溶栓藥物的新型代表,重組人纖溶酶原激活劑越來越受到血栓病患者的青睞,具有廣闊的應(yīng)用前景。外源基因在轉(zhuǎn)基因純合子動物的整合拷貝數(shù)是轉(zhuǎn)基因半合子動物的兩倍。本研究旨在篩選出轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔,比較外源基因rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔和轉(zhuǎn)基因半合子兔乳腺中的表達水平,探索在整合位點相同時,rhPA在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中的表達量與其拷貝數(shù)之間的關(guān)系。篩選高水平表達的轉(zhuǎn)基因純合子兔,培育用于生物制藥的rhPA的轉(zhuǎn)基因純合子兔品系,為以后大規(guī)模制備溶血栓生物藥品建立基礎(chǔ),并且用于藥理學(xué)和生物學(xué)活性分析,有利于后期藥品開發(fā)應(yīng)用。本研究應(yīng)用已經(jīng)構(gòu)建的乳腺特異表達載體PCL25/rhPA,通過原核期受精卵顯微注射制備轉(zhuǎn)rhPA基因家兔。經(jīng)過PCR整合檢測和ELISA表達檢測篩選出原代轉(zhuǎn)基因表達兔。F1代轉(zhuǎn)基因表達兔兄妹同胞交配或回交獲得F2代轉(zhuǎn)基因兔,通過對F2代轉(zhuǎn)基因兔測交篩選出其中的轉(zhuǎn)基因純合子兔。ELISA檢測比較轉(zhuǎn)基因純合子兔與半合子兔乳清中rhPA的表達水平。實驗以成年新西蘭母兔為實驗動物,將rhPA基因片段通過顯微注射導(dǎo)入受精卵,移植受體64只,其中46只懷孕,出生仔兔207只,PCR整合陽性兔56只,存活37只。妊娠率為71.9%,陽性整合率為27.1%。ELISA檢測37只轉(zhuǎn)基因兔(或后代)乳汁,其中12只兔乳腺特異性表達rhPA。獲得的rhPA基因表達公兔K29與正常新西蘭母兔交配,共獲得了F1代仔兔25只,經(jīng)PCR檢測篩選出F1代轉(zhuǎn)基因兔16只,其中母兔10只,公兔6只。從F1代轉(zhuǎn)基因兔中挑選公兔和母兔同胞交配,共獲得F2代仔兔10只,經(jīng)PCR檢測篩選出F2代轉(zhuǎn)基因兔5只,其中母兔4只,公兔1只。將F2代轉(zhuǎn)基因兔再與正常兔測交配種,通過對后代的PCR檢測,篩選出F2代中轉(zhuǎn)基因純合子兔。我們從F2代轉(zhuǎn)基因兔中篩選出2只雌性轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔(編號K29 F2-05和K29 F2-09)。通過對K29 F2-09奶樣的ELISA檢測,發(fā)現(xiàn)其乳汁中重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)的表達水平明顯高于半合子轉(zhuǎn)基因兔。本研究獲得了乳腺特異性表達轉(zhuǎn)基因兔,建立了PCL25/rhPA轉(zhuǎn)基因兔基本繁殖群(K29系),并培育篩選出2只轉(zhuǎn)rhPA基因純合了母兔(編號K29 F2-05和K29 F2-09),經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示K29 F2-09母兔奶樣中的rhPA表達量明顯高于轉(zhuǎn)rhPA基因半合子兔。實驗研究結(jié)果證明PCL25/rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔乳腺中的表達量高于轉(zhuǎn)基因半合子兔的表達量。本研究驗證了以培育轉(zhuǎn)基因純合子動物來提高外源基因表達量的可行性,為建立PCL25/rhPA轉(zhuǎn)基因純合子兔新品系做好鋪墊,更為大量研制新型溶栓制劑奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：血栓性疾病 人組織纖溶酶原激活劑 乳腺生物反應(yīng)器 顯微注射 轉(zhuǎn)基因純合子兔 PCR ELISA PCL25/rhPA
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R91;Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 英文名稱及縮寫詞9-11
• 第一章 文獻綜述11-20
• 1 溶栓藥物發(fā)展歷史11-13
• 1.1 血栓形成機制11-12
• 1.2 溶栓機理12
• 1.3 溶栓藥物發(fā)展歷史12-13
• 2 人組織纖溶酶原激活劑(t-PA)13-15
• 2.1 組織型纖溶酶原激活劑的發(fā)展過程13
• 2.2 組織型纖溶酶原激活劑的生物學(xué)特征13-15
• 3 轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白15-16
• 3.1 乳腺生物反應(yīng)器的原理15
• 3.2 動物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)勢15-16
• 4 乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組t-PA16-17
• 4.1 原核和真核細胞中t-PA的表達16
• 4.2 轉(zhuǎn)基因動物乳腺中t-PA的表達16-17
• 5 顯微注射法制備乳腺特異性表達轉(zhuǎn)基因動物17
• 5.1 顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動物17
• 5.2 建立轉(zhuǎn)基因乳腺生物反應(yīng)器17
• 6 乳腺特異性表達載體17-18
• 7 利用家兔制備乳腺生物反應(yīng)器18
• 8 轉(zhuǎn)基因純合子動物的優(yōu)勢18-20
• 第二章 重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)轉(zhuǎn)基因兔純合子的篩選及表達特性20-39
• 1 實驗材料20-22
• 1.1 實驗動物20
• 1.2 主要儀器20
• 1.3 主要藥品與分子生物學(xué)試劑20-21
• 1.4 主要試劑的配制21-22
• 1.5 菌種及質(zhì)粒22
• 1.6 引物合成及測序22
• 2 實驗方法22-30
• 2.1 顯微注射用基因片段的準(zhǔn)備22-24
• 2.2 轉(zhuǎn)基因兔的制備24-27
• 2.3 轉(zhuǎn)基因兔的整合檢測27-29
• 2.4 培育轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔29
• 2.5 轉(zhuǎn)基因純合子兔和轉(zhuǎn)基因雜合子兔的表達檢測29-30
• 3 實驗結(jié)果30-36
• 3.1 轉(zhuǎn)rhPA基因兔的獲得30-32
• 3.2 轉(zhuǎn)rhPA基因兔純合子的培育32-33
• 3.3 轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔的篩選33-34
• 3.4 轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔的測交34-35
• 3.5 rhPA基因純合子兔與半合子兔乳汁中rhPA表達量的比較35-36
• 4 討論36-37
• 5 總結(jié)37-39
• 參考文獻39-46
• 致謝46-47

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