本文關(guān)鍵詞：CYP2B6體外誘導(dǎo)活性評(píng)價(jià)模型的建立和應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CYP2B6是人細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)重要亞型之一,主要存在于肝臟中,其平均含量約占總CYP的2%-10%。CYP2B6參與多種內(nèi)源性以及外源性物質(zhì)的合成與生物轉(zhuǎn)化,尤其在臨床藥物,濫用藥物和外源性毒物的代謝中發(fā)揮重要的作用。CYP2B6具有高的可被誘導(dǎo)性,研究證明CYP2B6的基因表達(dá)可以被苯巴比妥類化合物,6-(4-氯苯基)咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-5-甲醛-O-(3,4-二氯苯基)肟(簡(jiǎn)稱CITCO),利福平等化合物誘導(dǎo)。隨著研究的深入,人們逐漸認(rèn)識(shí)到CYP2B6,受到核受體(nuclear receptors, NRs)孕烷X受體(PXR)和組成型雄甾烷受體(CAR)的共同調(diào)控。CYP2B6酶誘導(dǎo)易使部分藥物的藥效或毒性改變,甚至導(dǎo)致藥物臨床合用過(guò)程中出現(xiàn)藥物-藥物相互作用(drug-drug interacti on, DDI),引起臨床用藥不良反應(yīng)。因此,建立CYP2B6酶的誘導(dǎo)作用檢測(cè)篩選模型具有重要意義。本課題成功構(gòu)建了基于hPXR/CAR3的CYP2B6藥物誘導(dǎo)劑的報(bào)告基因分析法,并應(yīng)用該體外篩選體系進(jìn)行藥物體外誘導(dǎo)研究,篩選獲得能夠通過(guò)激活hPXR/CAR途徑,具有潛在轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)CYP2B6作用的中藥提取物和中藥活性成分。確證實(shí)驗(yàn)中,藥物處理過(guò)細(xì)胞裂解液分別進(jìn)行CYP2B6的RNA表達(dá)量、CYP2B6蛋白表達(dá)量和酶催化活力的測(cè)定。本課題的研究成果為預(yù)測(cè)和研究由于CYP2B6誘導(dǎo)引起的藥物相互作用提供檢測(cè)手段和理論依據(jù)。 一、人CYP2B6報(bào)告基因模型的建立和驗(yàn)證 以人基因組DNA為模板分別擴(kuò)增得到CYP2B6的遠(yuǎn)端和近端啟動(dòng)子序列,插入pGL3-promoter報(bào)告基因上游,構(gòu)建pGL3-CYP2B6-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒。以人肝cDNA為模板,擴(kuò)增得到hCAR3的編碼序列,插入pcDNA3.1(+)空載體,得到hCAR3重組表達(dá)質(zhì)粒。前期本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了hPXR的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hPXR。利用脂質(zhì)體將CYP2B6報(bào)告基因質(zhì)粒、hPXR或CAR3表達(dá)質(zhì)粒以及內(nèi)參海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入人肝癌HepG2細(xì)胞,以hPXR/CAR3陽(yáng)性激動(dòng)劑利福平和CITCO對(duì)CYP2B6的誘導(dǎo)倍數(shù)作為指標(biāo),優(yōu)化核受體的表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒的比例。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,即轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒和核受體表達(dá)質(zhì)粒相應(yīng)的空載體以考查細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的干擾,最終成功構(gòu)建并驗(yàn)證了基于hPXR/CAR3的人CYP2B6的報(bào)告基因體外篩選模型,為后續(xù)CYP2B6中藥誘導(dǎo)劑的篩選提供了可靠的檢測(cè)技術(shù)。 二、報(bào)告基因模型在人CYP2B6的中藥活性成分誘導(dǎo)劑篩選中的應(yīng)用 采用構(gòu)建的PXR/CAR介導(dǎo)的人CYP2B6報(bào)告基因模型,在24孔板上接種適量密度的HepG2細(xì)胞,24h后瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒,核受體表達(dá)質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒6h后,細(xì)胞用加藥培養(yǎng)基處理48h,測(cè)定熒光值。中藥提取物和中藥活性成分都用DMSO溶解,中藥提取物和活性成分儲(chǔ)備液的濃度分別為100mg/ml和10mmol/L,用培養(yǎng)基稀釋1000倍后作用于細(xì)胞,總濃度分別為100和10μmol/L.若藥物存在細(xì)胞毒性,則相應(yīng)降低處理細(xì)胞時(shí)濃度。考察了5種中藥提取物和85種中藥活性成分通過(guò)hPXR和hCAR3途徑對(duì)CYP2B6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,篩選得到白術(shù)和銀杏2種中藥提取物,黃酮類芹菜素,丹參的活性成分丹參酮ⅡA和隱丹參酮,五味子的活性成分五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子酯甲,銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B,胡椒堿,鉤藤堿,文多靈,蒿甲醚,二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯,熊果酸,莪術(shù)醇,白花前胡素A,白術(shù)的活性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ這19種中藥活性成分可以通過(guò)hPXR途徑對(duì)CYP2B6產(chǎn)生不同程度的誘導(dǎo)作用,其中蒿甲醚和白花前胡素A還可以通過(guò)hCAR3途徑對(duì)CYP2B6產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。為進(jìn)一步探討藥物濃度對(duì)誘導(dǎo)作用的影響,考察不同濃度的這些陽(yáng)性中藥活性成分對(duì)CYP2B6誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示這些中藥活性成分對(duì)CYP2B6的誘導(dǎo)效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。 三、確證8種中藥活性成分對(duì)人CYP2B6的誘導(dǎo)作用 通過(guò)分別檢測(cè)人CYP2B6的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和酶活性來(lái)確證中藥活性成分是否能誘導(dǎo)人CYP2B6。采用可以激活hPXR或hCAR3的中藥活性成分處理腸癌LS174T細(xì)胞72h,提取細(xì)胞總RNA并定量逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,分別設(shè)計(jì)針對(duì)人CYP2B6和內(nèi)參GAPDH的PCR引物,進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)人CYP2B6基因表達(dá)量變化。裂解LS174T細(xì)胞獲取總蛋白,用人CYP2B6的特異性抗體進(jìn)行Western Blot法檢測(cè)CYP2B6蛋白表達(dá)量變化。一相代謝酶CYP2B6催化探針底物安非他酮為羥基安非他酮,我們建立了代謝物羥基安非他酮在細(xì)胞破碎液中的LC-MS/MS分析方法,用于測(cè)定細(xì)胞破碎液體外孵育體系中羥基安非他酮的濃度,檢測(cè)人CYP2B6酶活性的變化。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),確證了二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、芹菜素、莪術(shù)醇、白花前胡素A、蒿甲醚、丹參酮ⅡA,隱丹參酮和鉤藤堿可以誘導(dǎo)人CYP2B6的RNA表達(dá)、蛋白表達(dá)和酶活性。提示這些中藥活性成分很有可能是人CYP2B6的潛在誘導(dǎo)劑,當(dāng)這些化合物與CYP2B6代謝的藥物同時(shí)服用時(shí)可能會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)CYP2B6而產(chǎn)生藥物-藥物相互作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)中藥新藥研發(fā)和臨床合理用藥具有一定的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：人CYP2B6 PXR/CAR 誘導(dǎo)作用 報(bào)告基因 中藥活性成分
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞11-13
• 目錄13-15
• 前言15-19
• 1. CYP2B6誘導(dǎo)機(jī)制和研究意義15-16
• 2. CYP2B6中藥誘導(dǎo)劑篩選現(xiàn)狀16-17
• 3. 報(bào)告基因法體外篩選模型17-18
• 4. 本研究的目的和方案18-19
• 第1章 hCAR3表達(dá)質(zhì)粒和CYP2B6報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建19-31
• 1. 引言19
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器與材料19-21
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-28
• 5. 討論28-29
• 6. 結(jié)論29-31
• 第2章 hPXR/CAR介導(dǎo)的CYP2B6的報(bào)告基因模型構(gòu)建31-39
• 1. 引言31
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器與材料31-33
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法33-35
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-37
• 5. 討論37-38
• 6. 結(jié)論38-39
• 第3章 基于hPXR/CAR配體的CYP2B6中藥誘導(dǎo)劑篩選39-57
• 1. 引言39
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器與材料39-41
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-54
• 5. 討論54-56
• 6. 結(jié)論56-57
• 第4章 CYP2B6中藥誘導(dǎo)劑的確證57-78
• 1. 引言57
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器與材料57-60
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法60-67
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-75
• 5. 討論75-77
• 6. 結(jié)論77-78
• 本研究的總結(jié)與主要?jiǎng)?chuàng)新性78-79
• 參考文獻(xiàn)79-83
• 綜述83-95
• 參考文獻(xiàn)90-95
• 作者簡(jiǎn)介95
• 在讀期間獲得的獎(jiǎng)項(xiàng)95
• 在讀期間發(fā)表的論文95

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：CYP2B6體外誘導(dǎo)活性評(píng)價(jià)模型的建立和應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：254591