本文關鍵詞：CYP2B6體外誘導活性評價模型的建立和應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CYP2B6是人細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)重要亞型之一,主要存在于肝臟中,其平均含量約占總CYP的2%-10%。CYP2B6參與多種內源性以及外源性物質的合成與生物轉化,尤其在臨床藥物,濫用藥物和外源性毒物的代謝中發(fā)揮重要的作用。CYP2B6具有高的可被誘導性,研究證明CYP2B6的基因表達可以被苯巴比妥類化合物,6-(4-氯苯基)咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-5-甲醛-O-(3,4-二氯苯基)肟(簡稱CITCO),利福平等化合物誘導。隨著研究的深入,人們逐漸認識到CYP2B6,受到核受體(nuclear receptors, NRs)孕烷X受體(PXR)和組成型雄甾烷受體(CAR)的共同調控。CYP2B6酶誘導易使部分藥物的藥效或毒性改變,甚至導致藥物臨床合用過程中出現(xiàn)藥物-藥物相互作用(drug-drug interacti on, DDI),引起臨床用藥不良反應。因此,建立CYP2B6酶的誘導作用檢測篩選模型具有重要意義。本課題成功構建了基于hPXR/CAR3的CYP2B6藥物誘導劑的報告基因分析法,并應用該體外篩選體系進行藥物體外誘導研究,篩選獲得能夠通過激活hPXR/CAR途徑,具有潛在轉錄誘導CYP2B6作用的中藥提取物和中藥活性成分。確證實驗中,藥物處理過細胞裂解液分別進行CYP2B6的RNA表達量、CYP2B6蛋白表達量和酶催化活力的測定。本課題的研究成果為預測和研究由于CYP2B6誘導引起的藥物相互作用提供檢測手段和理論依據(jù)。 一、人CYP2B6報告基因模型的建立和驗證 以人基因組DNA為模板分別擴增得到CYP2B6的遠端和近端啟動子序列,插入pGL3-promoter報告基因上游,構建pGL3-CYP2B6-Luc報告基因質粒。以人肝cDNA為模板,擴增得到hCAR3的編碼序列,插入pcDNA3.1(+)空載體,得到hCAR3重組表達質粒。前期本實驗室已經(jīng)構建了hPXR的表達質粒pcDNA3.1-hPXR。利用脂質體將CYP2B6報告基因質粒、hPXR或CAR3表達質粒以及內參海腎熒光素酶表達質粒pRL-TK瞬時共轉染入人肝癌HepG2細胞,以hPXR/CAR3陽性激動劑利福平和CITCO對CYP2B6的誘導倍數(shù)作為指標,優(yōu)化核受體的表達質粒和內參質粒的比例。同時設置對照組,即轉染報告基因質粒和核受體表達質粒相應的空載體以考查細胞內源性轉錄因子的干擾,最終成功構建并驗證了基于hPXR/CAR3的人CYP2B6的報告基因體外篩選模型,為后續(xù)CYP2B6中藥誘導劑的篩選提供了可靠的檢測技術。 二、報告基因模型在人CYP2B6的中藥活性成分誘導劑篩選中的應用 采用構建的PXR/CAR介導的人CYP2B6報告基因模型,在24孔板上接種適量密度的HepG2細胞,24h后瞬時共轉染報告基因質粒,核受體表達質粒及內參質粒6h后,細胞用加藥培養(yǎng)基處理48h,測定熒光值。中藥提取物和中藥活性成分都用DMSO溶解,中藥提取物和活性成分儲備液的濃度分別為100mg/ml和10mmol/L,用培養(yǎng)基稀釋1000倍后作用于細胞,總濃度分別為100和10μmol/L.若藥物存在細胞毒性,則相應降低處理細胞時濃度�？疾炝�5種中藥提取物和85種中藥活性成分通過hPXR和hCAR3途徑對CYP2B6的轉錄調控作用,篩選得到白術和銀杏2種中藥提取物,黃酮類芹菜素,丹參的活性成分丹參酮ⅡA和隱丹參酮,五味子的活性成分五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子酯甲,銀杏內酯A和銀杏內酯B,胡椒堿,鉤藤堿,文多靈,蒿甲醚,二氫歐山芹醇當歸酸酯,熊果酸,莪術醇,白花前胡素A,白術的活性成分白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅱ這19種中藥活性成分可以通過hPXR途徑對CYP2B6產(chǎn)生不同程度的誘導作用,其中蒿甲醚和白花前胡素A還可以通過hCAR3途徑對CYP2B6產(chǎn)生誘導作用。為進一步探討藥物濃度對誘導作用的影響,考察不同濃度的這些陽性中藥活性成分對CYP2B6誘導作用。結果顯示這些中藥活性成分對CYP2B6的誘導效應呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。 三、確證8種中藥活性成分對人CYP2B6的誘導作用 通過分別檢測人CYP2B6的基因表達、蛋白表達和酶活性來確證中藥活性成分是否能誘導人CYP2B6。采用可以激活hPXR或hCAR3的中藥活性成分處理腸癌LS174T細胞72h,提取細胞總RNA并定量逆轉錄為cDNA,分別設計針對人CYP2B6和內參GAPDH的PCR引物,進行real-time PCR檢測人CYP2B6基因表達量變化。裂解LS174T細胞獲取總蛋白,用人CYP2B6的特異性抗體進行Western Blot法檢測CYP2B6蛋白表達量變化。一相代謝酶CYP2B6催化探針底物安非他酮為羥基安非他酮,我們建立了代謝物羥基安非他酮在細胞破碎液中的LC-MS/MS分析方法,用于測定細胞破碎液體外孵育體系中羥基安非他酮的濃度,檢測人CYP2B6酶活性的變化。通過以上實驗,確證了二氫歐山芹醇當歸酸酯、芹菜素、莪術醇、白花前胡素A、蒿甲醚、丹參酮ⅡA,隱丹參酮和鉤藤堿可以誘導人CYP2B6的RNA表達、蛋白表達和酶活性。提示這些中藥活性成分很有可能是人CYP2B6的潛在誘導劑,當這些化合物與CYP2B6代謝的藥物同時服用時可能會通過誘導CYP2B6而產(chǎn)生藥物-藥物相互作用。上述實驗結果對中藥新藥研發(fā)和臨床合理用藥具有一定的指導意義。
【關鍵詞】：人CYP2B6 PXR/CAR 誘導作用 報告基因 中藥活性成分
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞11-13
• 目錄13-15
• 前言15-19
• 1. CYP2B6誘導機制和研究意義15-16
• 2. CYP2B6中藥誘導劑篩選現(xiàn)狀16-17
• 3. 報告基因法體外篩選模型17-18
• 4. 本研究的目的和方案18-19
• 第1章 hCAR3表達質粒和CYP2B6報告基因質粒的構建19-31
• 1. 引言19
• 2. 實驗儀器與材料19-21
• 3. 實驗方法21-26
• 4. 實驗結果26-28
• 5. 討論28-29
• 6. 結論29-31
• 第2章 hPXR/CAR介導的CYP2B6的報告基因模型構建31-39
• 1. 引言31
• 2. 實驗儀器與材料31-33
• 3. 實驗方法33-35
• 4. 實驗結果35-37
• 5. 討論37-38
• 6. 結論38-39
• 第3章 基于hPXR/CAR配體的CYP2B6中藥誘導劑篩選39-57
• 1. 引言39
• 2. 實驗儀器與材料39-41
• 3. 實驗方法41-46
• 4. 實驗結果46-54
• 5. 討論54-56
• 6. 結論56-57
• 第4章 CYP2B6中藥誘導劑的確證57-78
• 1. 引言57
• 2. 實驗儀器與材料57-60
• 3. 實驗方法60-67
• 4. 實驗結果67-75
• 5. 討論75-77
• 6. 結論77-78
• 本研究的總結與主要創(chuàng)新性78-79
• 參考文獻79-83
• 綜述83-95
• 參考文獻90-95
• 作者簡介95
• 在讀期間獲得的獎項95
• 在讀期間發(fā)表的論文95

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 李曉莉;李曉蓉;王麗娟;李宇航;徐艷霞;薛明;;單用與復方給藥后隱丹參酮在家兔體內的藥物動力學比較[J];中國藥理學通報;2007年08期

2 馮婉玉,李金鳴,張克義;白花前胡甲素對豚鼠心肌細胞電生理特性的影響[J];中國藥學雜志;1998年11期

3 馬哲;梁茂新;;二氫歐山芹醇當歸酸酯在家兔體內的藥動學[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2010年21期

4 王君燕;余露山;曾蘇;;人孕烷X受體介導的UGT1A1報告基因模型的建立及初步應用[J];中國藥學雜志;2012年14期

5 胡冰芳;畢惠嫦;黃民;;孕烷X受體及組成性雄甾烷受體的研究新進展[J];藥學學報;2011年10期

6 徐聰;徐思云;胡海紅;余露山;曾蘇;;CYP2B6體外誘導活性評價模型的建立及其在中藥活性成分篩選的應用[J];藥學學報;2013年01期

  本文關鍵詞：CYP2B6體外誘導活性評價模型的建立和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：254591