本文關(guān)鍵詞：“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的成模性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西南大學(xué)》 2013年

“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的成模性研究

薛強  

【摘要】：背景： “腦神經(jīng)血管單元”是包括大腦神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管等在內(nèi)的一個整體概念,在腦神經(jīng)血管疾病的研究和治療中具有重要意義。課題組前期用原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,采用Tanswell細(xì)胞培養(yǎng)小池,在體外初步建立了“腦神經(jīng)血管單元”整體結(jié)構(gòu)模型,但其方法還不夠穩(wěn)定成熟,對于整體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性及其與在體功能的吻合性的驗證還不足。本文的研究是在前期工作基礎(chǔ)上進行方法學(xué)的改進、穩(wěn)定,使其成熟,并驗證其整體結(jié)構(gòu)的相互關(guān)聯(lián)性及其與在體“腦神經(jīng)血管單元”功能的相似性 本課題獲得了教育部博十學(xué)科點專項基金(博導(dǎo)類：20110182110012)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項目(渝中醫(yī)2010[60]2010-1-4)的支持。 目的： 1.改進并穩(wěn)定建模用三種細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和神經(jīng)血管單元三細(xì)胞共培養(yǎng)模型建立方法,為進一步研究提供穩(wěn)定成熟的技術(shù)手段。 2.研究細(xì)胞特異性蛋白在缺氧復(fù)氧損傷不同時間點的表達及其相互關(guān)系,驗證體外建立的“腦神經(jīng)血管單元”模型與在體功能的相似性。 方法： 1.建模用三種大鼠腦細(xì)胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定方法的改進和穩(wěn)定 建立大鼠腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定新方法本研究直接將25%的BSA加入獲取的皮質(zhì)層碎塊中,勻漿后梯度離心取微血管段,用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化獲取微血管內(nèi)皮細(xì)胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),不添加生長因子,在傳代時通過差異消化法純化,用兔抗Ⅷ因子進行鑒定。 大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化與鑒定方法的改進改進課題組前期用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,用阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長來純化,用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)進行鑒定的方法：本研究中,采用DMEM/F12培養(yǎng)基添加無血清B27進行培養(yǎng)與純化,用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白質(zhì)2(MAP-2)進行鑒定。 大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定方法的穩(wěn)定方法同課題組前期方法：分離新生3d內(nèi)大鼠皮質(zhì)層星形膠質(zhì)細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),通過搖瓶去除非星形膠質(zhì)細(xì)胞,用兔抗GFAP鑒定。 2.“腦神經(jīng)血管單元”體外共培養(yǎng)模型建立方法的改進與穩(wěn)定 改變前期選用半透明transwell培養(yǎng)小池,神經(jīng)元培養(yǎng)傳代后接種到培養(yǎng)孔底,0.4mL/孔星形膠質(zhì)細(xì)胞混懸液接種,培養(yǎng)2d后接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本研究選用透明的transwell培養(yǎng)小池,神經(jīng)元直接接種在培養(yǎng)板孔底培養(yǎng)純化,在transwell膜外側(cè)種植1mL的星形膠質(zhì)細(xì)胞混懸液,貼壁后將小池插入神經(jīng)元培養(yǎng)孔,1d后在transwell膜內(nèi)側(cè)種植純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,共培養(yǎng)3d后用于模型評價和相關(guān)實驗。通過倒置相差顯微鏡觀察三種細(xì)胞生長狀態(tài)、檢測4h滲漏試驗和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值,評價模型構(gòu)建成功與否,評價正常培養(yǎng)時,該模型屏障功能與在體生理條件下的相似性。 3.“腦神經(jīng)血管單元”體外共培養(yǎng)模型氧復(fù)氧損傷方法的建立與穩(wěn)定 將建模成功的培養(yǎng)池內(nèi)培養(yǎng)基換成無血清缺氧液,放入持續(xù)通入混合氣體的、37℃恒溫恒濕的缺氧裝置中處理4h,再將缺氧液換成復(fù)氧液,于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。通過倒置相差顯微鏡觀察模型中三種細(xì)胞生長狀態(tài)、檢測4h滲漏試驗和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值,評價模型缺氧復(fù)氧損傷的成功與否；評價缺氧復(fù)氧損傷后,該模型屏障功能變化與在體病理條件下的相似性。 4.“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷中細(xì)胞特異性蛋白動態(tài)變化研究 在缺氧前、復(fù)氧0h、復(fù)氧2h、復(fù)氧6h、復(fù)氧12h及復(fù)氧24h六個時間點分別提取不同培養(yǎng)方式下三種細(xì)胞蛋白,經(jīng)過前處理后用WB方法檢測神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5、星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達。通過比較上述功能蛋白在缺氧復(fù)氧損傷時表達變化與在體缺血再灌注損傷過程中表達變化,評價缺氧復(fù)氧損傷后,該模型中細(xì)胞功能變化與在體病理條件下的相似性。 結(jié)果： 1.方法改進后,分離培養(yǎng)的三種建模用新生大鼠腦原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)均一呈現(xiàn)出各自典型的生長特征。經(jīng)特異性蛋白鑒定,神經(jīng)元純度達95%以上,較改進前提高10%；星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達96%以上,較改進前提高6%；微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度達99%以上,較改進前提高4%。改進后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法操作簡單,耗時短,不需添加昂貴的生長因子,且節(jié)約動物使用量。 2.本研究采用透明transwell膜來改進了課題組前期用半透明transwell膜建立三細(xì)胞共培養(yǎng)模型的方法,并優(yōu)化建模中細(xì)胞種植時間、數(shù)量等條件,建立了穩(wěn)定的三細(xì)胞共培養(yǎng)模型,不僅使建模時間縮短,而且便于直接觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和拍照。三細(xì)胞共培養(yǎng)體中,細(xì)胞共生長良好,星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體粗大并充分伸展、微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成單層、神經(jīng)元軸突形成致密的網(wǎng)絡(luò),基本符合在體生長形態(tài)。通過比較單細(xì)胞培養(yǎng)、雙細(xì)胞共培養(yǎng)和三細(xì)胞共培養(yǎng)生長結(jié)果,表明三細(xì)胞共培養(yǎng)模型細(xì)胞之間具有明顯的相互促進生長的整體協(xié)同效應(yīng)。4h滲漏試驗中各孔液面均無明顯下降,跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值達到268.3±6.5(Ωcm2)。表明該模型具有“腦神經(jīng)血管單元”中基本的屏障功能,相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”的部分生理功能。 3.缺氧復(fù)氧損傷后,三種細(xì)胞形態(tài)變化較大。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)胞體回縮,細(xì)胞間隙增加,神經(jīng)元突觸縮短并減少,但三細(xì)胞共培養(yǎng)模型中細(xì)胞形態(tài)受損程度小于雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)。顯示三細(xì)胞共培養(yǎng)體缺氧復(fù)氧損傷后,與在體腦組織缺血再灌注損傷后細(xì)胞形態(tài)變化相似,而且較單細(xì)胞或雙細(xì)胞培養(yǎng)具有更強的抗損傷能力。與損傷前相比：三細(xì)胞共培養(yǎng)體4h滲漏試驗降低顯著(P0.01)�？鐑�(nèi)皮細(xì)胞電阻值為227.1±3.3(Q cm2),下降明顯(P0.01)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后。該三細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細(xì)胞病理變化。 4.雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)時,神經(jīng)元GAP-43和微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5的表達在復(fù)氧后0-2h就極顯著降低(P0.001);三細(xì)胞共培養(yǎng)體中,神經(jīng)元GAP-43在復(fù)氧后6h才開始明顯降低(P0.05),該兩種蛋白在復(fù)氧后12h才達到極顯著降低(P0.001)。雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)時,星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達在復(fù)氧后0-2h就極顯著升高(P0.001)；在三細(xì)胞共培養(yǎng)體中,其表達在復(fù)氧后2h才顯著升高(P0.05),在復(fù)氧24h時才達到極顯著升高(P0.001)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后,三細(xì)胞共培養(yǎng)體與在體腦組織缺血再灌注損傷后細(xì)胞蛋白變化相似,而且較單細(xì)胞或雙細(xì)胞培養(yǎng)具有更強的抗損傷能力。該三細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細(xì)胞蛋白病理變化。 結(jié)論： 1.本研究建立了一種新的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,改進了大鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法,穩(wěn)定了大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。所獲得的大鼠腦皮層三種原代細(xì)胞純度較高,為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)方法,也可作為相關(guān)研究細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)參考。 2.本研究改進并穩(wěn)定了“腦神經(jīng)血管單元”體外模型建模方法,使建模時間縮短,且便于直接觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和拍照。所建模型中的三種腦細(xì)胞具有類似于在體腦組織細(xì)胞之間相互促進生長的作用,具有生理屏障功能。顯示所建立的模型具有與在體“腦神經(jīng)血管單元”相似的部分生理功能。 3.本研究建立了穩(wěn)定的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷方法。該方法損傷后,“腦神經(jīng)血管單元”體外模型具有相似于在體腦組織細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化特點。該方法損傷后“腦神經(jīng)血管單元”體外模型中神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5和星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達,具有類似于在體缺血再灌注損傷后腦組織細(xì)胞蛋白的變化特點。 4.與單細(xì)胞培養(yǎng)或者雙細(xì)胞培養(yǎng)比較,三細(xì)胞共培養(yǎng)模型細(xì)胞之間具有明顯的相互促進生長的整體協(xié)同效應(yīng)�！澳X神經(jīng)血管單元”體外模型中細(xì)胞在缺氧復(fù)氧損傷條件下,更加具有類似于在體腦組織細(xì)胞之間相互保護、增強抵御損傷能力的作用。 5.綜上所述,本研究改建了“腦神經(jīng)血管單元”體外模型。所獲得的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型,較之單細(xì)胞培養(yǎng)或者雙細(xì)胞培養(yǎng)模型,更具有類似于在體的“腦神經(jīng)血管單元”的主要細(xì)胞成分、基本形態(tài)結(jié)構(gòu),基本生理功能、基本病理變化特點,可作為腦神經(jīng)血管疾病及其治療藥物篩選的體外研究工具。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R965.1
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的成模性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：134949