本文關(guān)鍵詞：rAAV2介導(dǎo)IGF-I基因聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨骼肌鈍挫傷小鼠修復(fù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨骼肌損傷的防治一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和難點(diǎn),其傷后炎癥反應(yīng)期長(zhǎng),愈合質(zhì)量較差,容易形成瘢痕愈合。盡管國(guó)內(nèi)在分子生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但是目前在臨床仍未能找到預(yù)防和治療骨骼肌損傷公認(rèn)的最佳方案。研究目的:本實(shí)驗(yàn)對(duì)ICR小鼠進(jìn)行骨骼肌鈍挫傷造模后,采用rAAV2介導(dǎo)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進(jìn)行干預(yù)治療,從組織學(xué)、生物化學(xué)等不同的研究層次和角度,探討基因及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨骼肌損傷的治療作用及可能機(jī)制,比較單純基因治療、單純間充質(zhì)干細(xì)胞、以及兩者聯(lián)合干預(yù)對(duì)骨骼肌鈍挫傷小鼠的修復(fù)效果,豐富相應(yīng)研究資料。研究方法:動(dòng)物分組與處理:將68只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(4只)和實(shí)驗(yàn)組(64只),實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后平均分為四組,每組16只,各實(shí)驗(yàn)組又根據(jù)取材時(shí)間不同,分為傷后3天組,傷后7天組,傷后14天組,傷后21天組。基因治療組(rAAV-IGF-Ⅰ)在造模后即刻用微量注射器注射40μL重組腺相關(guān)病毒,間充質(zhì)干細(xì)胞組(MSC)注射106個(gè)細(xì)胞,聯(lián)合治療組(rAAV-IGF-Ⅰ-MSC)注射經(jīng)腺相關(guān)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞106個(gè),自然愈合組注射40μL PBS。分別在損傷后3d、7d、14d、21d處死動(dòng)物,眼球取血,留取血清,Eppendoff管密封保存于-80℃冰箱待測(cè);速取損傷區(qū)域腓腸肌,用生理鹽水將殘留血液清洗干凈,其中二分之一置于凍存管中在液氮中速凍3-4小時(shí),然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測(cè),另外二分之一肌肉用10%福爾馬林固定,用于HE染色觀察及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果:(1)重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的近紅外熒光蛋白iRFP713能夠在受傷肌肉組織中廣泛表達(dá),對(duì)照組無表達(dá)。(2)HE染色光鏡觀察、血漿CK活性變化表明MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能促進(jìn)小鼠急性腓腸肌鈍挫傷后的肌肉再生,減少疤痕形成,提高愈合質(zhì)量。(3)外源IGF-Ⅰ能在小鼠腓腸肌中穩(wěn)定表達(dá),在第14d時(shí),IGF-Ⅰ含量從高到低分別為rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組、rAAV-IGF-Ⅰ組、MSC組、自然愈合組、安靜對(duì)照組。(4)MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠局部組織Collagen-Ⅰ、ⅢmRNA的表達(dá),第7d、14d、21d,Collagen-ⅠmRNA的表達(dá)量均低于自然愈合組(P0.01),第3d,rAAV-IGF-Ⅰ組與自然愈合組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其余兩組差異顯著(P0.05)。第14d,rAAV-IGF-Ⅰ-MSC與MSC組也表現(xiàn)出非常顯著性差異(P0.01)。21天,rAAV-IGF-Ⅰ組是MSC組的76%(P0.01),rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組是MSC組的58%(P0.01)。小鼠發(fā)生急性骨骼肌損傷3天和第7天時(shí),各治療組Collagen-ⅢmRNA的表達(dá)量與自然愈合組相比均有顯著性差異(P0.01),組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第14d,MSC組是自然愈合組的74%(P0.05),rAAV-IGF-Ⅰ組是自然愈合組的63%(P0.01),rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組自然愈合組的42%(P0.01)。rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組的Collagen-ⅢmRNA的表達(dá)量與MSC組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第21天,rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC兩組的Collagen-ⅢmRNA的表達(dá)量均低于自然愈合組(P0.01)。研究結(jié)論:(1)MSC及IGF-Ⅰ對(duì)小鼠急性骨骼肌損傷有治療作用(2)MSC對(duì)急性骨骼肌損傷小鼠腓腸肌作用時(shí)間較快,但作用持續(xù)時(shí)間較短(3)rAAV2介導(dǎo)的IGF-Ⅰ對(duì)急性骨骼肌損傷小鼠腓腸肌作用時(shí)間較慢,但作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)久(4)rAAV-IGF-Ⅰ-MSC治療組要優(yōu)于單純MSC和rAAV-IGF-Ⅰ治療組。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌鈍挫傷 重組2型腺相關(guān)病毒 胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ 間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R873
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 序言10-12
• 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1.胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）概述12-14
• 1.1 IGF-Ⅰ的生物學(xué)功能13
• 1.2 IGF-Ⅰ對(duì)骨骼肌的作用13-14
• 2.腺相關(guān)病毒概述14-16
• 3.間充質(zhì)干細(xì)胞概述16-20
• 3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)16-17
• 3.2 MSC的臨床應(yīng)用前景17-19
• 3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨骼肌損傷19-20
• 4 骨骼肌損傷概述20-25
• 4.1 骨骼肌損傷的分類20-21
• 4.2 急性骨骼肌損傷的造模方法21-22
• 4.3 骨骼肌損傷的治療方法22-25
• 1 材料與方法25-42
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組25
• 1.2 小鼠腓腸肌急性鈍挫傷模型的建立25
• 1.3 攜帶人IGF-Ⅰ基因的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV2-IGF-Ⅰ）包裝及鑒定25-35
• 1.3.1 pTR-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ質(zhì)粒構(gòu)建25-31
• 1.3.2 pAAV-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ、PDG質(zhì)粒的大量制備31
• 1.3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ病毒包裝31-32
• 1.3.4 rAAV2-IGF-Ⅰ的分離和純化32-33
• 1.3.5 rAAV2-IGF-Ⅰ滴度測(cè)定33-34
• 1.3.6 重組病毒鑒定34-35
• 1.4 小鼠肌肉注射細(xì)胞、病毒35-36
• 1.5 取材與指標(biāo)檢測(cè)36-40
• 1.5.1 血液、肌肉取材36
• 1.5.2 HE染色36
• 1.5.3 IGF-Ⅰ 免疫組化及圖像分析36-37
• 1.5.4 小鼠腓腸肌Collagen-ⅠmRNA、Collagen-Ⅲ mRNA含量測(cè)定37-39
• 1.5.5 小鼠血清肌酸激酶（CK）酶聯(lián)免疫分析39-40
• 1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑40-41
• 1.6.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器40-41
• 1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理41-42
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-56
• 2.1 RAAV2 IGF-Ⅰ病毒包裝結(jié)果及其在細(xì)胞內(nèi)IRFP713報(bào)告基因的表達(dá)42-47
• 2.1.1 pTR-EGFP-IRES-IGF-Ⅰ質(zhì)粒鑒定結(jié)果42
• 2.1.2 pTR-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ質(zhì)粒鑒定結(jié)果42-43
• 2.1.3 pAAV-IRFP713-IRES-IGF-Ⅰ質(zhì)粒鑒定結(jié)果43-44
• 2.1.4 rAAV2-IGF-Ⅰ腺相關(guān)病毒包裝、鑒定及病毒滴度測(cè)定44-46
• 2.1.5 rAAV2 IGF-Ⅰ腺相關(guān)病毒感染細(xì)胞及功能基因IGF-Ⅰwestern-blot鑒定46-47
• 2.2 肌肉注射rAAV2-IGF-Ⅰ、rAAV2-IGF-Ⅰ-MSC后iRFP報(bào)告基因表達(dá)比較47
• 2.3 各組小鼠肌肉組織HE染色光鏡結(jié)果觀察比較47-50
• 2.4 各組小鼠肌肉組織IGF-Ⅰ免疫組化結(jié)果比較50-52
• 2.5 不同治療方法對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠腓腸肌Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)的影響52-54
• 2.6 不同治療方法對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠血清CK含量的影響54-56
• 3 分析與討論56-61
• 3.1 腺相關(guān)病毒作為骨骼肌損傷基因治療表達(dá)載體的可行性56
• 3.2 骨骼肌急性損傷后各組別的自然愈合過程56-57
• 3.3 骨骼肌損傷后各組別Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達(dá)57-59
• 3.4 骨骼肌損傷后各組別血清CK濃度變化59-61
• 4 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 攻讀碩士期間公開發(fā)表的論文69-70
• 致謝70-71

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本文編號(hào)：437802