發(fā)布時間：2017-05-19 03:15

  本文關(guān)鍵詞：甲基苯丙胺對大鼠心室肌細胞凋亡及鈣離子通道蛋白表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 甲基苯丙胺又稱去氧麻黃堿、甲基安非他明,其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,結(jié)晶狀似冰樣,在我國俗稱“冰毒”,是最常見的新型毒品之一。甲基苯丙胺具有較強的中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感能效應(yīng)。其依賴性較強,可以一次成癮,劑量大時可出現(xiàn)中毒和死亡。 隨著甲基苯丙胺的濫用,使用者并發(fā)心血管疾病,如心律失常、心肌缺血、夾層動脈瘤、高血壓,甚至肥厚性心肌病、急性冠脈綜合癥、充血性心力衰竭猝死的例子也屢見不鮮。甲基苯丙胺對心血管系統(tǒng)的毒性作用可能是多數(shù)甲基苯丙胺濫用者導(dǎo)致死亡的原因。因此,甲基苯丙胺對心血管毒性作用的研究正逐漸成為相關(guān)領(lǐng)域的熱點和重點。 到目前為止,甲基苯丙胺誘導(dǎo)急性心肌梗塞已被廣泛報道。在心臟功能衰竭的過程中,心肌細胞凋亡起了關(guān)鍵作用。終末期心肌病患者,可以觀察到由于心肌細胞凋亡,導(dǎo)致心肌細胞減少,發(fā)展到心臟功能障礙,最終導(dǎo)致心臟功能衰竭。這個提醒我們,甲基苯丙胺很有可能通過相關(guān)途徑,誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,最終引起嚴重的心臟相關(guān)疾病而導(dǎo)致其服用者的死亡。 L-型鈣離子通道(LTCCs)是細胞外Ca2+進入細胞的重要門戶,是心肌興奮-收縮偶聯(lián)的重要結(jié)構(gòu),ICa-L在心肌細胞動作電位形成中具有重要作用。構(gòu)成心肌細胞LTCCs的重要亞單位有α1c、β2、α2/δ,相關(guān)調(diào)控蛋白亞基RyR2, SERCA2a和NCX各亞單位的表達改變與ICa-L的改變相關(guān)。臨床報道,對使用甲基苯丙胺后發(fā)生心血管異常癥狀的患者使用地高辛、鈣離子通道阻滯劑,有緩解癥狀、改善心血管功能的作用。說明甲基苯丙胺可能導(dǎo)致鈣通道相關(guān)蛋白功能和表達的改變,這些改變參與甲基苯丙胺引起的心血管損傷,其在甲基苯丙胺導(dǎo)致的心律失常過程中可能起著重要作用。 本實驗以體外、體內(nèi)兩種實驗手段,研究甲基苯丙胺是否可以引起細胞凋亡?如何激活細胞調(diào)亡途徑?是否可以影響心室肌鈣電流相關(guān)蛋白功能和表達?以探討甲基苯丙胺對心臟毒性的作用,特別是導(dǎo)致室性心律失常發(fā)生的機制。 目的： 通過在體外環(huán)境構(gòu)建甲基苯丙胺染毒原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性模型,了解甲基苯丙胺對心室肌細胞的直接損傷作用,對心室肌細胞凋亡的影響和對鈣離子通道相關(guān)蛋白的表達及功能影響,探討甲基苯丙胺影響鈣離子電流相關(guān)蛋白的功能與表達最終導(dǎo)致室性心律失常發(fā)生的分子機制和電生理機制。 通過在體內(nèi)環(huán)境分別構(gòu)建甲基苯丙胺急性染毒大鼠心室肌毒性模型,驗證體外環(huán)境甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性作用；分別建立甲基苯丙胺急性染毒大鼠及停藥不同時間的恢復(fù)模型。探討由甲基苯丙胺所引起的心室肌病理性損傷及分子水平損傷的可恢復(fù)能力和停止染毒后不同時間的恢復(fù)能力。 方法： 本實驗分成兩個大部分,分別從體外與體內(nèi)兩個方向?qū)谆奖芬鸬男氖壹《拘赃M行研究。 一、甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性研究 1、甲基苯丙胺導(dǎo)致原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞凋亡。 (1)出生1天內(nèi)的SD乳鼠,雌雄不拘,心室肌細胞分離及原代培養(yǎng),將培養(yǎng)72h已呈規(guī)律搏動的心室肌細胞隨機分為四組,棄去培養(yǎng)基,Hank's液輕柔洗滌一次,按照0.5/1.0/1.5mM濃度分別給予含有相應(yīng)濃度甲基苯丙胺的D-MEM液,并設(shè)立對照組,一并放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。 (2)甲基苯丙胺染毒后對心室肌細胞進行形態(tài)學(xué)觀察。 (3)甲基苯丙胺染毒后心室肌細胞TUNEL凋亡檢測,觀察甲基苯丙胺對心室肌細胞的毒性作用。 2、甲基苯丙胺導(dǎo)致原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞凋亡機制研究 (1)實時熒光定量PCR技術(shù)及Western Blot技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞IGFBP5基因和蛋白表達。 (2)RNA干擾(RNAi)技術(shù)：沉默IGFBP5基因后原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞IGFBP5的蛋白表達。 (3) TUNEL凋亡檢測技術(shù)：檢測沉默IGFBP5基因后甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞的凋亡情況。 (4) Western Blot技術(shù)：檢測沉默IGFBP5對甲基苯丙胺引起的心室肌細胞caspase-3蛋白表達變化的影響。 3、甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌離子調(diào)控蛋白影響 (1)實時熒光定量PCR技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞LTCC α1c、β2、SERCA2a、NCX和RyR2基因表達水平。 (2) Western Blot技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞LTCC α1c、β2、SERCA2a、NCX和RyR2蛋白表達水平。 二、甲基苯丙胺對大鼠心室肌毒性研究 1、急性組與其停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠模型建立 (1)急性組(AM組)：200-220g SD雄性大鼠10只,單籠飼養(yǎng)于空調(diào)恒溫26℃,晝夜循環(huán)(晝14h/天)動物房,自由進食飲水,適應(yīng)一周后5mg/Kg甲基苯丙胺生理鹽水溶液,兩次/日(8AM及8PM各一次),連續(xù)給藥十四次(七天)。建模成功24小時內(nèi)心臟取材。 (2)急性停藥組(AW組)：200-220g SD雄性大鼠40只,隨機分成AW1、AW2、AW4和AW8四組,每組10只,單籠飼養(yǎng)于空調(diào)恒溫26℃,晝夜循環(huán)(晝14h/天)動物房,自由進食飲水,適應(yīng)一周后5mg/Kg甲基苯丙胺生理鹽水溶液,兩次/日(8AM及8PM各一次),連續(xù)給藥一周,一周后停藥喂養(yǎng)一周、二周、四周、八周,建模成功24小時內(nèi)心臟取材。 (3)急性對照組(AC組)：200-220g SD雄性大鼠10只,將甲基苯丙胺生理鹽水溶液換為等量生理鹽水溶液,余處理同急性中毒組,建模成功24小時內(nèi)心臟取材。 2、急性組與其停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠心室肌病理學(xué)研究 將取材樣本放入4%中性甲醛緩沖液中室溫固定24h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,做HE染色。鏡下觀察心室肌形態(tài)學(xué)改變,比較各組大鼠心室肌病理改變情況。 3、甲基苯丙胺對急性組與其停藥組大鼠心室肌通道蛋白影響 (1)實時熒光定量PCR技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用急性組與其停藥組大鼠LTCCα1c,β2基因表達水平。 (2) Western Blot技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用急性組與其停藥組大鼠LTCC α1c,β2蛋白表達水平。 結(jié)果： 一、甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性研究 1、心室肌細胞形態(tài)學(xué)變化 原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞24-48h,細胞互相接觸形成細胞簇,搏動同步化,頻率在70-90次/分,搏動細胞超過95%。甲基苯丙胺給藥0-24h觀察,0.5mM組細胞形態(tài)未見明顯變化,細胞搏動加快。48-72h,細胞搏動漸恢復(fù)至70-90次/分,搏動較規(guī)則,少數(shù)出現(xiàn)變圓、扁梭、折光性加強等病變。1.OmM組細胞形態(tài)未見明顯變化,細胞搏動加快。48-72h,細胞搏動漸平復(fù)并明顯減慢為50-70次/分,搏動不規(guī)則,細胞出現(xiàn)變圓、扁梭、折光性加強等明顯病變,隨著時間延長,細胞損傷加重,最終停止搏動,自皿上脫落、死亡。1.5mM組細胞與1.0mM組相比更嚴重。 2、TUNEL法檢測甲基苯丙胺作用后原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞的凋亡 TUNEL法檢測甲基苯丙胺作用后原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞的凋亡率隨甲基苯丙胺濃度增加逐漸升高,對照組未見心肌細胞發(fā)生凋亡；0.5mmol/L濃度組(凋亡率為5.01±0.225%)及1.0mmol/L濃度組(凋亡率為7.50±0.340%)開始出現(xiàn)凋亡細胞,散在分布,無明顯特點；1.5mmol/L濃度組(凋亡率為31.43±0.896%)心肌細胞發(fā)生明顯凋亡。0.5mmol/L、1. Ommol/L、1.5mmol/L濃度組與對照組相比凋亡率均有顯著性差異(P0.01)。 3、甲基苯丙胺導(dǎo)致原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞凋亡機制研究 甲基苯丙胺作用后原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞,對照組(相對表達量為1.00±0.010)IGFBP5基因表達相對較低；0.5mmol/L濃度組(相對表達量為1.53±0.126)及1.0mmol/L濃度組(相對表達量為1.98±0.140)開始出現(xiàn)表達上調(diào),但不明顯；1.5mmol/L濃度組(相對表達量為4.67±0.210)心室肌細胞IGFBP5基因表達明顯上調(diào)。0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L濃度組與對照組相比相對表達量均有顯著性差異(P0.01)。對照組(相對表達量為1.00±0.010)IGFBP5基因的蛋白水平表達相對較低；0.5mmol/L濃度組(相對表達量為1.98±0.035)及1.0mmol/L濃度組(相對表達量為1.98±0.035)開始出現(xiàn)表達上調(diào),但不明顯；1.5mmol/L濃度組(相對表達量為1.98±0.035)心室肌細胞IGFBP5基因的蛋白水平表達明顯上調(diào)。0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L濃度組與對照組相比相對表達量均有顯著性差異(P0.01)。 TUNEL法檢測沉默IGFBP5基因后1.5mM甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞的凋亡。0mM+siNC組為非特異性的小干擾RNA序列并且沒有甲基苯丙胺作用的對照組,對照組未見心肌細胞發(fā)生凋亡：與1.5mM+siNC組(凋亡率為10.00±0.403)相比,1.5mM+siIGFBP5-1組(凋亡率為5.90±0.986)和1.5mM+siIGFBP5-2組(凋亡率為4.33±0.872)P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,沉默IGFBP5基因后1.5mM甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞,其凋亡率明顯下降,有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌離子調(diào)控蛋白影響 我們觀察到甲基苯丙胺可以抑制了原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌L型鈣離子通道α1c,β2亞基的基因(α1c:Con為1.003±0.009,MA為0.469±0.021；β2：Con為1.003±0.006,MA為0.455±0.032)及蛋白(α1c:Con為1.000±0.000,MA為0.228±0.027；β2：Con為1.000±0.000,MA為0.545±0.037)表達水平,同時上調(diào)鈣離子相關(guān)調(diào)控蛋白SERCA2a, NCX和RyR2的基因(SERCA2a:Con為0.999±0.0.002,MA為2.244±0.052; NCX: Con為1.001±0.002,MA為1.894±0.038；RyR2:Con為1.001±0.002,MA為3.033±0.111)及蛋白(SERCA2a:Con為1.000±0.000,MA為2.124±0.044；NCX:Con為1.000±0.000,MA為1.653±0.034; RyR2:Con為1.000±0.000,MA為2.875±0.059)表達水平。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 二、甲基苯丙胺對大鼠心室肌毒性研究 1、急性組與其停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠心室肌病理學(xué)研究 急性組大鼠心室肌細胞HE染色可見波浪樣變、顆粒樣變、收縮帶壞死、小梗死灶形成、間質(zhì)出血、心肌細胞斷裂、嗜酸性增強,局灶性心肌間質(zhì)纖維增多、少許炎細胞浸潤,對照組大鼠心肌細胞平滑,未見淤血、水腫等改變。 急性停藥組大鼠心室肌細胞HE染色可見,在停藥一周后,嚴重的病理改變開始恢復(fù),在停藥兩周后,病理改變進一步恢復(fù),四周之后開始出現(xiàn)肉芽組織,纖維化形成。 2、甲基苯丙胺對急性組與其停藥組大鼠心室肌通道蛋白影響 對于CACNA1C基因及CACNB2基因,與對照組S1組相比急性組M1組表達明顯下降,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與急性組M1組相比W1組表達無明顯變化,P0.05,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。與急性組M1組相比W2組表達無明顯變化,P0.05,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。與急性組M1組相比W4組表達表達開始上調(diào),P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與急性組M1組相比W8組表達表達開始上調(diào),P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 甲基苯丙胺給藥后心室肌內(nèi)鈣離子調(diào)控相關(guān)蛋白的mRNA水平及蛋白水平表達的下降,其中CACNAIC的mRNA表達下降44%,蛋白表達下降41%,CACNB2的mRNA表達下降67%,蛋白表達下降55%。 其中CACNAIC在甲基苯丙胺停藥后一周及兩周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在甲基苯丙胺停藥四周后,mRNA表達恢復(fù)33%,蛋白表達恢復(fù)55%,在甲基苯丙胺停藥八周后,mRNA表達恢復(fù)64%,蛋白表達恢復(fù)66%。 其中CACNB2在甲基苯丙胺停藥后一周及兩周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在甲基苯丙胺停藥四周后,mRNA表達恢復(fù)68%,蛋白表達恢復(fù)44%,在甲基苯丙胺停藥八周后,mRNA表達恢復(fù)93%,蛋白表達恢復(fù)94%。 結(jié)論： 甲基苯丙胺可以直接導(dǎo)致心室肌細胞的損傷而不通過神經(jīng)、體液的調(diào)節(jié),且心室肌細胞損傷及變化的嚴重程度與給藥濃度呈正比。 甲基苯丙胺通過上調(diào)IGFBP5,進而激活了半胱氨酸蛋白酶-3途徑,最終誘導(dǎo)心室肌細胞發(fā)生凋亡,是半胱氨酸蛋白酶-3依賴通路介導(dǎo)的細胞凋亡。 甲基苯丙胺通過影響心室肌細胞鈣循環(huán)通路蛋白LTCCa亞基(CACNAIC),β2亞基(CACNB2), RyR2, SERCA2a和NCX及基因表達,干擾細胞內(nèi)鈣離子平衡,直接抑制了心臟收縮功能,心肌傳導(dǎo)速度下降,是一個導(dǎo)致心律失常的危險因素。 在動物實驗,甲基苯丙胺可以影響鈣離子通道的主要亞基CACNA1C,、CACNB2,進而影響L型鈣離子電流,其可能是甲基苯丙胺誘發(fā)心律失常的關(guān)鍵因素。這種影響可以在停止用藥一個月后得到恢復(fù),但是不同基因其恢復(fù)能力不同,其中CACNA1C恢復(fù)能力較差,其可能是甲基苯丙胺誘導(dǎo)心臟損傷的康復(fù)期晚期心律失常發(fā)生的一個可能的誘導(dǎo)因素。
【關(guān)鍵詞】：甲基苯丙胺 心肌毒性 凋亡 IGFBP5 鈣離子通道 心律失常
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 前言20-29
• 第一章 甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性研究29-72
• 第一節(jié) 甲基苯丙胺導(dǎo)致原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞凋亡29-38
• 1.1 材料與方法29-33
• 1.2 結(jié)果33-36
• 1.3 討論36-38
• 第二節(jié) 甲基苯丙胺導(dǎo)致原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞凋亡機制研究38-62
• 2.1 方法與材料38-47
• 2.2 結(jié)果47-59
• 2.3 討論59-62
• 第三節(jié) 甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌離子調(diào)控蛋白影響62-68
• 3.1 方法與材料62-64
• 3.2 結(jié)果64-67
• 3.3 討論67-68
• 參考文獻68-72
• 第二章 甲基苯丙胺對中毒及戒斷模型大鼠心室肌毒性研究72-96
• 第一節(jié) 急性甲基苯丙胺中毒及戒斷大鼠模型建立72-77
• 1.1 材料與方法72-74
• 1.2 結(jié)果74-75
• 1.3 討論75-77
• 第二節(jié) 急性甲基苯丙胺中毒及戒斷大鼠心室肌病理學(xué)研究77-83
• 2.1 材料與方法77-79
• 2.2 結(jié)果79-81
• 2.3 討論81-83
• 第三節(jié) 急性甲基苯丙胺中毒及戒斷大鼠心室肌通道蛋白影響83-94
• 3.1 材料和方法83-85
• 3.2 結(jié)果85-92
• 3.3 討論92-94
• 參考文獻94-96
• 全文小結(jié)96-97
• 中英文縮略對照表97-98
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況98-99
• 致謝99-101

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;MYOCARDIAL LESIONS AFTER LONG-TERM ADMINISTRATION OF METHAMPHETAMINE IN RATS[J];Chinese Medical Sciences Journal;2008年04期

  本文關(guān)鍵詞：甲基苯丙胺對大鼠心室肌細胞凋亡及鈣離子通道蛋白表達的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377676