本文關(guān)鍵詞：微量接觸類(lèi)生物檢材的快速處置策略探究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脫氧核糖核酸(DNA)檢驗(yàn)技術(shù)通過(guò)對(duì)犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的血跡、精斑、唾液斑、毛發(fā)等物證的檢驗(yàn)來(lái)認(rèn)定和排除嫌疑人,在辦案中發(fā)揮著重要作用。檢驗(yàn)流程通常包括：檢材提取,DNA提取定量,聚合酶連反應(yīng)(PCR)復(fù)合擴(kuò)增,毛細(xì)管電泳獲取短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分型,整個(gè)過(guò)程大致需要10-12個(gè)小時(shí)。如果縮短操作時(shí)間,簡(jiǎn)化步驟,不僅能減少工作量,還能提高檢驗(yàn)速度,從而滿足案件偵查和訴訟對(duì)于時(shí)效性的要求。生物物證經(jīng)過(guò)前處理獲得DNA之后,需要通過(guò)多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增,獲得常染色體或Y染色體STR分型,這是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中的常規(guī)方法。PCR是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一,通過(guò)變性、退火和延伸的循環(huán)來(lái)完成核酸分子的擴(kuò)增。普通PCR擴(kuò)增過(guò)程一般需要3個(gè)小時(shí),這是物證檢驗(yàn)的限速過(guò)程,如果能將此過(guò)程縮短,將會(huì)顯著提高物證檢驗(yàn)速度。快速PCR是基于普通PCR的工作原理,在保證PCR特異性、靈敏性和保真度的前提下,在更短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)核酸分子的擴(kuò)增。近年來(lái),快速PCR主要從三個(gè)方面進(jìn)行了研發(fā)：聚合酶的改進(jìn)、添加劑的研發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造�？焖倬酆厦甘峭ㄟ^(guò)基因工程手段獲得的具有高延伸活性和速率的耐熱DNA聚合酶,目前商品化的快速聚合酶有Takara公司的SpeedSTARTM HS、Fermentas公司的PyroStartTM Fast PCR Master Mix、Kappa公司的KAPA2G Fast PCR Kits等,不同聚合酶的保真度、特異性等都有差別。快速擴(kuò)增儀是通過(guò)快速傳熱設(shè)計(jì)模式或增加熱傳導(dǎo)速率,使儀器的升/降溫速率提高到6-15℃/s。如德國(guó)Analytik Jena公司的SpeedCycler2、Eppendorf公司的Mastercycler pro等。快速擴(kuò)增技術(shù)已被用于病原體檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域,但針對(duì)法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用研究還很少。在建立快速PCR體系的過(guò)程中,首先確保體系特異性、準(zhǔn)確性、靈敏度等重要參數(shù)不受影響,然后才是提高擴(kuò)增速率。微量接觸類(lèi)物證是目前檢案中的疑難物證,也是目前法醫(yī)遺傳領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。微量接觸類(lèi)物證是通過(guò)皮膚或粘膜接觸而形成的一種物證,如刀柄、鑰匙、手機(jī)、衣帽鞋襪、手套、門(mén)把手、果核、牙刷、飲料罐等客體上可能遺留有皮膚表皮脫落細(xì)胞或粘膜上皮細(xì)胞,此類(lèi)潛在的生物物證,檢驗(yàn)結(jié)果可能成為案件偵破的關(guān)鍵。此類(lèi)物證由于檢驗(yàn)成功率低,需要反復(fù)檢驗(yàn)而成為案件檢驗(yàn)的限速步驟。伴隨犯罪智能化水平的提高,血跡、毛發(fā)、精斑等明顯的物證常被有意識(shí)的破壞,而微量接觸類(lèi)物證由于量少不易被識(shí)別往往被忽略。自從1997年van Oorschot等首次報(bào)道接觸DNA以來(lái),此類(lèi)物證越來(lái)越受到關(guān)注,檢驗(yàn)量也不斷增多,以公安部物證鑒定中心為例,近兩年每年檢驗(yàn)四萬(wàn)余份DNA檢材,其中約40%為微量接觸類(lèi)物證。此類(lèi)物證由于只有少量脫落細(xì)胞或DNA,肉眼很難判斷樣本具體部位盲目剪取,有時(shí)并沒(méi)有取到樣本靶細(xì)胞,剪取檢材過(guò)大又會(huì)降低DNA的濃度,或引入外來(lái)污染,所以檢出率低。國(guó)內(nèi)在“十一五”期間,雖然研制了脫落細(xì)胞收集、提取等裝置,但是針對(duì)此類(lèi)物證仍缺乏系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論研究。實(shí)際上,滲透性、非滲透性等不同載體表面接觸DNA的含量、保存時(shí)間、DNA二次轉(zhuǎn)移發(fā)生率、適用的提取方法等都有很大差別,相關(guān)問(wèn)題的系統(tǒng)研究和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的積累可以有效避免盲目提取和重復(fù)檢驗(yàn),并且對(duì)于確定檢材的檢驗(yàn)順序、提取部位、提取方法等快速處置和檢驗(yàn)策略有重要指導(dǎo)意義。從犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集生物物證時(shí)通常稱(chēng)為一次轉(zhuǎn)移,在物證從犯罪現(xiàn)場(chǎng)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)之前,這些物證通常保存在公安機(jī)構(gòu)指定的物證袋中,在此過(guò)程中,物證與物證袋之間相互接觸,羅卡定律指出“凡兩個(gè)物體接觸,必會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象”,因此物證會(huì)轉(zhuǎn)移到物證袋,產(chǎn)生二次轉(zhuǎn)移或多次轉(zhuǎn)移。近年來(lái),關(guān)于DNA來(lái)源于游離DNA或細(xì)胞內(nèi)DNA的問(wèn)題也成為了此類(lèi)物證的一個(gè)重要研究方向。所以本課題擬在前期基礎(chǔ)上,針對(duì)微量接觸類(lèi)生物物證,以手部接觸類(lèi)物證為研究對(duì)象,研究不同載體上DNA的檢出量和檢驗(yàn)效果、前處理方法、檢驗(yàn)時(shí)效、DNA二次轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移率、游離DNA的存在及與細(xì)胞內(nèi)DNA比例等相關(guān)問(wèn)題。根據(jù)快速聚合酶、熱循環(huán)儀、AmpFLSTR(?) Identifiler(?) Plus試劑盒引物和公安部物證鑒定中心研發(fā)的19個(gè)位點(diǎn)的引物進(jìn)行篩選和優(yōu)化,建立適合法醫(yī)常用的快速擴(kuò)增技術(shù)。從物證的快速處置和擴(kuò)增兩方面入手,通過(guò)系統(tǒng)探究生物物證中的DNA含量、保存時(shí)間、來(lái)源、二次轉(zhuǎn)移等基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)問(wèn)題和快速PCR相關(guān)研究,建立適合微量接觸類(lèi)生物物證的快速檢驗(yàn)技術(shù)。針對(duì)微量接觸類(lèi)檢材的相關(guān)研究：制備檢材,分別用直接剪取法、膠帶粘取法、兩步擦拭法和真空吸取法對(duì)檢材進(jìn)行前處理,然后進(jìn)行DNA提取,篩選最佳前處理方法,用最佳前處理方法處理放置不同時(shí)間段的檢材,時(shí)間段為一年(2、6、10、30、60、90、180和360天)之內(nèi),觀察此類(lèi)檢材檢驗(yàn)效力的變化。針對(duì)二次轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)制備檢材,使用塑料物證袋和紙質(zhì)物證袋提取物證,模擬物證運(yùn)輸過(guò)程,分別使用常規(guī)程序?qū)ξ镒C袋和物證進(jìn)行DNA提取、定量和擴(kuò)增,并對(duì)各項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行分析和討論,觀察物證袋的轉(zhuǎn)移效力。針對(duì)游離DNA實(shí)驗(yàn),制備檢材,對(duì)游離DNA和細(xì)胞內(nèi)分別進(jìn)行定量和STR擴(kuò)增,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和討論,觀察游離DNA和細(xì)胞內(nèi)DNA的比例,及游離DNA對(duì)此類(lèi)檢材檢驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)室溫度保持22-24℃,空氣相對(duì)濕度為50%。DNA提取方法為磁珠法,具體操作參照M48 QIAGEN(?)試劑盒使用說(shuō)明。用7500Real-Time PCR systems和QuantifierTM Human DNA quantification kit對(duì)DNA進(jìn)行定量,AmpFLSTR(?)Identifiler(?) Plus試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,ABI3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行電泳,GeneMapper ID V3.3軟件分析數(shù)據(jù)。每組均設(shè)置空白試劑陰性對(duì)照和9947陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果以質(zhì)量的形式呈現(xiàn),以各等位基因峰高大于50RFUs者為有效分型結(jié)果。平均等位基因數(shù)=有效分型結(jié)果總數(shù)/樣本數(shù)。檢測(cè)率=檢測(cè)到的樣本數(shù)/樣本總數(shù)。用Student's t test、One-Way ANOVA、 Mann-Whitney U-test和Kruskal-Wallis one-way analysis of variance進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算。實(shí)驗(yàn)觀察到總體上使用直接剪取法進(jìn)行前處理的檢材提取到的DNA量大于使用兩步擦拭法和真空吸取法進(jìn)行前處理提取到的DNA量,且四種前處理方法在針對(duì)不同載體的檢材上有差異；隨著時(shí)間推移,放置360天內(nèi)的DNA檢出量和檢驗(yàn)效果無(wú)明顯變化。二次轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)觀察到100%的檢材發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移,其DNA轉(zhuǎn)移率平均為22.06%,紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋的平均轉(zhuǎn)移率分別為為26.27%和17.85%,所有樣本在紙質(zhì)和塑料物證袋中的轉(zhuǎn)移率有差別(p=0.023),紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率較高。接觸類(lèi)樣本與非接觸類(lèi)樣本的轉(zhuǎn)移率有差別(p=3.14E-49),接觸類(lèi)樣本的轉(zhuǎn)移率較高。游離DNA的實(shí)驗(yàn)觀察到,75.6%的樣品檢測(cè)到了游離DNA,其中,手部、面部、足部檢材和口腔試子的游離DNA檢測(cè)率分別為82.1%、82.1%、53.6%和96.4%,微量接觸類(lèi)檢材中游離DNA量占DNA總量的12.9%。針對(duì)快速PCR的相關(guān)研究：分別研究了七種快速酶、常用的STR擴(kuò)增試劑盒和兩臺(tái)熱循環(huán)儀,從縮短擴(kuò)增時(shí)間和提高擴(kuò)增效力的角度出發(fā)進(jìn)行調(diào)整、比較和優(yōu)化,優(yōu)選出擴(kuò)增時(shí)間最短和擴(kuò)增效力最好的酶。應(yīng)用此酶優(yōu)化好的擴(kuò)增體系和程序進(jìn)行一系列驗(yàn)證評(píng)價(jià)。研究構(gòu)建了一個(gè)關(guān)于TAKARA SpeedSTAR酶和AmpFLSTR(?) Identifiler(?) Plus試劑盒中的引物的10μL擴(kuò)增體系和程序,此程序在熱循環(huán)儀上耗時(shí)僅為25min。同時(shí)構(gòu)建一個(gè)關(guān)于含有19個(gè)位點(diǎn)的混合引物和Roche FastStart酶的10μL擴(kuò)增體系和程序,此程序在普通熱循環(huán)儀上耗時(shí)僅為69min。,經(jīng)驗(yàn)證,兩個(gè)體系和程序均可應(yīng)用于血液、口腔拭子、脫落細(xì)胞、精斑、骨骼及牙齒等常規(guī)檢材,靈敏度均為0.25 ng,準(zhǔn)確性均為100%。結(jié)論：微量接觸類(lèi)檢材的相關(guān)研究明確了滲透性載體的DNA檢測(cè)量高于非滲透性載體的DNA檢測(cè)量,不同的前處理方法在針對(duì)不同載體時(shí)存在差異,檢材常溫干燥放置一年內(nèi),其DNA無(wú)明顯降解。在物證的提取過(guò)程中,DNA會(huì)轉(zhuǎn)移到物證袋造成潛在的DNA丟失,紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率較高,微量接觸類(lèi)檢材的轉(zhuǎn)移率高于其他檢材。接觸類(lèi)檢材中提取到的DNA,除了細(xì)胞內(nèi)DNA,還存在一定比例的游離DNA,且會(huì)影響檢材最終的分型結(jié)果。近年來(lái),此類(lèi)檢材占據(jù)了案件中的主要部分,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果將有助于指導(dǎo)針對(duì)此類(lèi)檢材的檢驗(yàn),為其快速檢驗(yàn)提供新途徑,為存放不同時(shí)間后檢材檢驗(yàn)的必要性提供數(shù)據(jù)證明,為公安機(jī)構(gòu)和科研院所提供可靠的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù),提高此類(lèi)檢材的物證證明力,為案件偵破和科研研究提供有力支持。在實(shí)際案件中,尤其目前此類(lèi)檢材是最常見(jiàn)的檢材之一,即使微量DNA的丟失也可能會(huì)造成最終DNA無(wú)分型或者分型缺失,這些丟失的DNA可能成為案件偵破的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)所涉及的檢材均為干燥性檢材,排除了濕性的影響,為犯罪現(xiàn)場(chǎng)干燥性檢材的提取、存儲(chǔ)和運(yùn)輸提供了新的見(jiàn)解和幫助。隨著進(jìn)一步研究檢材的不同特性,干燥性和濕性檢材以及不同環(huán)境對(duì)二次轉(zhuǎn)移的影響等將有望對(duì)物證的存儲(chǔ)、提取和運(yùn)輸提供更為便利和合適的方法。游離DNA的發(fā)現(xiàn)以及與細(xì)胞內(nèi)DNA量的比例為案件中此類(lèi)檢材的有效發(fā)現(xiàn)、提取和檢驗(yàn)提供了重要論點(diǎn)和依據(jù),為相關(guān)技術(shù)和裝置研究提供了重要科學(xué)基礎(chǔ)。從縮短擴(kuò)增時(shí)間和調(diào)整擴(kuò)增體系和程序出發(fā),快速擴(kuò)增檢驗(yàn)研究系統(tǒng)優(yōu)化了七種快速酶和兩組引物,建立了兩組在縮短擴(kuò)增時(shí)間上很有優(yōu)勢(shì)的擴(kuò)增體系和程序,為整個(gè)DNA檢驗(yàn)過(guò)程縮短了時(shí)間,提高了法醫(yī)檢驗(yàn)的效率,滿足了案件偵查和訴訟對(duì)于時(shí)效性要求,提升了生物物證的證據(jù)價(jià)值和證明力,為公安機(jī)關(guān)進(jìn)行PCR擴(kuò)增提供了便利,滿足了科研院所對(duì)快速擴(kuò)增檢驗(yàn)的要求,通過(guò)系統(tǒng)研究、篩選、構(gòu)建和優(yōu)化適合于法醫(yī)常規(guī)檢材的擴(kuò)增體系和程序,為更進(jìn)一步的快速酶和熱循環(huán)儀的改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)�？傮w上,本研究針對(duì)微量接觸類(lèi)生物檢材的快速處置策略做了系統(tǒng)研究,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終形成了適合此類(lèi)物證的快速處置和檢驗(yàn)策略,從而提高了法醫(yī)檢驗(yàn)的效率,提升了生物物證的證據(jù)價(jià)值和證明力。
【關(guān)鍵詞】：法醫(yī)物證學(xué) 微量接觸類(lèi)檢材 快速?gòu)?fù)合擴(kuò)增 短串聯(lián)重復(fù)序列 聚合酶鏈反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：D919
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-19
• 第一章 前言19-25
• 1.1 簡(jiǎn)介19-20
• 1.2 研究背景20-22
• 1.3 研究意義和應(yīng)用前景22
• 1.4 技術(shù)方案22-24
• 1.5 小結(jié)24-25
• 第二章 實(shí)驗(yàn)試劑及常規(guī)程序簡(jiǎn)介25-30
• 2.1 AmpFLSTR Identifiler Plus試劑盒25-26
• 2.2 AmpFLSTR Yfiler試劑盒26-27
• 2.3 Typerl5 plus試劑盒27-28
• 2.4 M48 QIAGEN(?)試劑盒28
• 2.5 QuantifilerTM Human DNA quantification試劑盒28-30
• 第三章 微量接觸類(lèi)檢材的前處理方法篩選及檢驗(yàn)時(shí)效探究30-49
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.2 主要儀器和試劑30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制30-31
• 3.3.2 滲透性載體的微量接觸類(lèi)DNA檢材制備31
• 3.3.3 非滲透性載體的微量接觸類(lèi)DNA檢材制備31-32
• 3.3.4 放置不同時(shí)間段的檢材制備32
• 3.3.5 檢材檢驗(yàn)過(guò)程32-33
• 3.3.6 數(shù)據(jù)分析33
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
• 3.4.1 定量結(jié)果33-40
• 3.4.2 分型結(jié)果40-43
• 3.4.3 放置不同時(shí)間段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 3.5 結(jié)果討論與分析45-49
• 第四章 微量接觸類(lèi)檢材的二次轉(zhuǎn)移研究49-57
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料49
• 4.2 主要儀器和試劑49
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法49-51
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制49
• 4.3.2 微量接觸類(lèi)DNA檢材的制備49-50
• 4.3.3 非接觸類(lèi)DNA檢材的制備50
• 4.3.4 檢材檢驗(yàn)過(guò)程50-51
• 4.3.5 數(shù)據(jù)分析51
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-55
• 4.5 結(jié)果討論與分析55-57
• 第五章 微量接觸類(lèi)檢材的游離DNA問(wèn)題探究57-66
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制57
• 5.2.2 檢材制備57
• 5.2.3 檢材檢驗(yàn)過(guò)程57-58
• 5.2.4 數(shù)據(jù)分析58
• 5.3 結(jié)果58-64
• 5.4 結(jié)果討論與分析64-66
• 第六章 針對(duì)Typer15 plus引物的快速擴(kuò)增體系的構(gòu)建66-72
• 6.1 實(shí)驗(yàn)樣品66
• 6.2 主要試劑和儀器66
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法66-67
• 6.3.1 DNA提取和定量66-67
• 6.3.2 快速PCR擴(kuò)增體系和程序的建立和優(yōu)化67
• 6.3.3 快速PCR擴(kuò)增體系技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證67
• 6.3.4 數(shù)據(jù)分析67
• 6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-71
• 6.5 結(jié)果討論與分析71-72
• 第七章 針對(duì)Identifiler和Yfiler引物的快速擴(kuò)增體系的構(gòu)建72-83
• 7.1 實(shí)驗(yàn)樣品72
• 7.2 主要試劑和儀器72
• 7.3 實(shí)驗(yàn)方法72-75
• 7.3.1 DNA提取和定量72-73
• 7.3.2 快速PCR擴(kuò)增體系和程序的建立和優(yōu)化73-75
• 7.3.3 快速PCR擴(kuò)增體系技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證75
• 7.3.4 數(shù)據(jù)分析75
• 7.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-81
• 7.5 結(jié)果討論與分析81-83
• 參考文獻(xiàn)83-89
• 成果89-91
• 致謝91-92

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 董正志;韓清順;郭科建;蔣綱;劉建軍;;觸摸痕中接觸DNA檢驗(yàn)概述[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2015年03期

2 董會(huì);王晶;李彩霞;張濤;劉超;;不同載體上微量接觸類(lèi)檢材的相關(guān)問(wèn)題探究[J];生命科學(xué)研究;2015年02期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 法塞;特發(fā)性低促性腺激素性腺功能減退癥及嚴(yán)重性腺功能減退的中國(guó)患者GnRHR基因分子缺陷[D];華中科技大學(xué);2013年

2 法塞（Aws Khalid Fathi）;特發(fā)性低促性腺激素性腺功能減退癥及嚴(yán)重性腺功能減退的中國(guó)患者GnRHR基因分子缺陷[D];華中科技大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：微量接觸類(lèi)生物檢材的快速處置策略探究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：303263