研究背景:隨著電離輻射的日益廣泛應用,開發(fā)低毒高效的輻射防護劑迫在眉睫。近年來,NF-κB逐漸成為輻射防護領(lǐng)域的研究熱點,對其激活可誘發(fā)細胞多種促存活事件,對正常組織產(chǎn)生輻射防護作用。然而,激活NF-κB還可引發(fā)炎癥因子爆發(fā)、腫瘤細胞能量代謝改變等諸多反應。因此,如何駕馭NF-κB使其發(fā)揮對正常組織的輻射防護作用,避免其副作用,增強腫瘤放療效果,引起了我們的研究興趣。研究表明,通過TLRs受體激活NF-κB可以很好地實現(xiàn)這一目的。因此,本課題第一部分圍繞新型TLR4激動劑MPLA對小鼠多器官輻射損傷防護效應及機制展開了研究。此外,還針對MPLA對腫瘤細胞放射敏感性的影響進行了檢驗。在第二部分中,則主要圍繞IR對癌細胞NF-κB相關(guān)代謝關(guān)鍵酶ACSL家族的影響、Acsl6在調(diào)節(jié)腫瘤放療敏感性方面的重要作用及其分子機制、MPLA聯(lián)合敲除Acsl6基因提高腫瘤細胞放射敏感性等幾個方面展開了深入研究。研究目的:1.明確MPLA體內(nèi)外輻射防護效應2.探索MPLA輻射防護作用的分子機制3.檢測MPLA對腫瘤細胞放射敏感性的影響4.對癌細胞照后不同ACSL同工酶轉(zhuǎn)錄水平變化進行篩選5.驗證Acsl6敲除提高腫瘤細胞放射敏感性的作用6.探究Acsl6敲除放射增敏機制7.初步驗證MPLA聯(lián)合ACSL6敲除可提高腫瘤放療效果研究方法:1.細胞培養(yǎng)與處理:采用HUVEC,L02,RAW264.7,LLC和RM9細胞。MPLA給藥實驗于IR前12小時加藥(1μg/ml用DMSO溶解),對照組給予相應劑量DMSO。2.實驗動物:動物實驗采用6—8周齡的野生型C57BL/6小鼠,TLR4(-/-)小鼠以及TRIF突變型小鼠(TRIF~(mutant))。MPLA給藥以生理鹽水溶解,劑量為1μg/mouse,0.1ml/mouse,方式為灌胃強飼,時間為IR前12h。3.γ射線照射:第一部分采用海軍軍醫(yī)大學輻照中心Co~(60)-γ射線照射源;第二部分采用美國德州大學西南醫(yī)學中心放射腫瘤學部分子放射生物學系~(137)Cs-γ射線照射源。4.細胞活力檢測:采用CCK-8法檢測細胞活力。5.凋亡檢測:采用Annexin V/PI雙染法以流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。6.細胞周期檢測:應用PI單染法檢測,FlowJo軟件分析。7.動物取材:照后不同時間點處死小鼠,分離組織,制作單細胞懸液。8.彗星電泳實驗:采用玻片雙層凝膠法以中性細胞電泳進行。9.Western Blot:參照WB實驗一般流程進行。10.ELISA實驗:采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測小鼠血清細胞因子。11.組織學檢測:采用石蠟切片+HE染色法對動物組織進行組織學檢測。12.p65、γ-H2AX免疫熒光分析:主要步驟:制作細胞爬片、施加處理因素、固定、穿膜、封閉、孵育一抗二抗、封片、觀察分析。13.NF-κB熒光素酶檢測:經(jīng)過構(gòu)建NF-κB基因與熒光素酶基因的融合質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后以熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測。14.克隆形成實驗:所有克隆形成實驗均采用直徑為6cm的細胞培養(yǎng)皿進行細胞培養(yǎng)、血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)(以確保細胞分散良好)、先鋪板后照射、無水乙醇固定、結(jié)晶紫染色、Oxford Optronix細胞群落計數(shù)器自動計數(shù)(確保計數(shù)客觀)、SigmaPlot 13.0分析作圖(LQ模型擬合生存曲線)。15.qRT-PCR實驗:主要步驟:總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄cDNA、實時熒光定量PCR。16.Acsl6 KO細胞的構(gòu)建:我們以CRISPR Cas9技術(shù)構(gòu)建KO細胞系,最后經(jīng)過有限稀釋法篩選穩(wěn)定敲除了目的基因的細胞株。17.Acsl6 KO Rescue細胞株構(gòu)建:首先構(gòu)建含有FLAG和Acsl6 cDNA的質(zhì)粒,經(jīng)過轉(zhuǎn)化、克隆篩選、質(zhì)粒擴增與鑒定,將得到目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入LLC細胞,用G418進行施壓、篩選,最后以WB進行蛋白鑒定。18.細胞糖酵解檢測:采用Cayman的L-Lactate檢測試劑盒,通過比色法檢測細胞外L-乳酸的水平進而反映細胞糖酵解程度。19.ROS檢測:本實驗主要采用了CM-H2DCFDA試劑盒進行ROS標記染色,并以流式細胞術(shù)檢測熒光信號來反應待測細胞ROS水平。20.AVOs染色細胞自噬檢測:采用吖啶橙染色法標記酸性自噬小體、裂解小體等,結(jié)合熒光顯微鏡拍照以及流式細胞儀定量的方法完成。21.統(tǒng)計分析:應用Excel、SPSS 21對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,以GraphPad Prism 6、SigmaPlot 13.0進行繪圖。兩組間比較用兩獨立樣本的t檢驗進行,P值小于0.05認為其具有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果:一、MPLA輻射防護作用及機制研究1.MPLA可以有效減輕IR所致細胞凋亡,促進細胞照后DNA損傷修復凋亡檢測發(fā)現(xiàn)MPLA顯著降低了IR引起的細胞凋亡;而細胞周期檢測顯示MPLA有效降低了IR導致的G2/M期周期阻滯;彗星電泳實驗顯示MPLA有效減少了IR所致細胞核拖尾程度,且OTM和TM值均顯著降低。2.MPLA對照后小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)的輻射防護作用IR引起了小鼠骨髓空虛化且損傷程度呈進行性加重,骨髓有核細胞計數(shù)于照后第三天顯著降低,而MPLA明顯改善了這些損傷情況。同時,MPLA提高了照后小鼠B220~-且CD34~+骨髓細胞的比例。3.MPLA對小鼠脾臟具有TLR4依賴的輻射防護作用IR引起了小鼠脾臟白髓面積、數(shù)目明顯縮小,而MPLA能夠有效增加其白髓范圍;脾細胞凋亡檢測結(jié)果顯示,MPLA能夠明顯降低輻射引發(fā)的脾細胞凋亡率,并且有效扭轉(zhuǎn)了IR引發(fā)的脾細胞CD4~+/CD8~+比例失調(diào)。然而,這些MPLA對脾臟的輻射防護效果并未出現(xiàn)在TLR4-/-小鼠中,說明了該效應依賴TLR4而發(fā)揮。4.MPLA可減輕小鼠的睪丸、小腸輻射損傷,提高照后動物生存率MPLA顯著改善了睪丸、小腸的組織學輻射損傷;且有效提高了不同致死劑量、不同照射方式下的動物生存率。5.MPLA的輻射防護作用依賴于TLR4我們以TLR4-/-小鼠為研究對象,發(fā)現(xiàn)MPLA未能扭轉(zhuǎn)IR對骨髓、脾臟等造成的組織學損傷,不能改善骨髓有核細胞、脾細胞等的輻射損傷,說明MPLA的輻射防護作用依賴于TLR4受體而發(fā)揮。6.MPLA激活TLR4后啟動MAPK信號通路(p38途徑)并且提高了NF-kB p65核轉(zhuǎn)位及其轉(zhuǎn)錄活性通過WB實驗,我們發(fā)現(xiàn)MPLA促進了IKK-β的磷酸化,而免疫熒光實驗顯示MPLA誘導了明顯的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,與此同時,熒光素酶檢測提示MPLA顯著提高了細胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄水平。7.MPLA主要通過Myd88介導TLR4信號通路轉(zhuǎn)導以RAW264.7為研究對象,通過siRNA分別敲低TRIF以及Myd88基因,檢測細胞凋亡。MPLA顯著降低了IR引起的WT及TRIF KD細胞的凋亡率,而對Myd88KD細胞無保護作用。此外,通過對TRIF~(mutant)小鼠組織學檢測發(fā)現(xiàn),MPLA僅部分改善了IR造成的骨髓細胞缺失,而對脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷無影響。8.MPLA可改善IR引起的高炎性狀態(tài)以及Th1/Th2免疫失衡以ELISA法檢測不同處理組小鼠血清細胞因子含量。結(jié)果顯示,MPLA+IR組中IL-6及TNF-α水平相對于IR組顯著降低;進一步研究發(fā)現(xiàn),MPLA能夠改善IR造成的小鼠Th1/Th2免疫失衡。9.MPLA對LLC、RM9輻射敏感性的影響以LLC、RM9為研究對象,通過平板克隆形成實驗檢測MPLA對癌細胞輻射敏感性的影響。結(jié)果顯示,MPLA均未增加兩種腫瘤細胞輻射抗性。二、ACSL6對腫瘤細胞放射敏感性的影響及其分子機制研究1.ACSL系列同工酶對腫瘤細胞放射生物學反應的影響篩選通過qRT-PCR的手段分別對LLC及RM9 IR之后ACSL五種同工酶基因轉(zhuǎn)錄水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)只有Acsl6基因在IR之后48h顯著上調(diào);對于LLC,IR之后24h即出現(xiàn)了Acsl6的明顯增高。2.構(gòu)建Acsl6敲除細胞系利用CRISPR Cas9技術(shù)對LLC、RM9細胞成功進行了Acsl6基因的敲除以及穩(wěn)定敲除細胞株的篩選。3.Acsl6 KO顯著降低了腫瘤細胞IR之后克隆形成能力以LLC、LLC KO1、LLC KO3、RM9以及RM9 KO為研究對象,行克隆形成實驗檢測細胞的放射敏感性變化。結(jié)果顯示,所有基因敲除組細胞克隆形成能力明顯降低。4.Acsl6 KO參與LLC細胞Warburg效應的調(diào)節(jié)利用比色法檢測了細胞外L-乳酸含量,以反映細胞的有氧糖酵解水平。實驗結(jié)果顯示,將Acsl6敲除之后,LLC在IR之后2h、24h的乳酸水平顯著降低。然而,RM9細胞并未出現(xiàn)此現(xiàn)象。5.Acsl6 KO活化了LLC中能量代謝調(diào)控因子AMPK,但對RM9未產(chǎn)生明顯影響AMPK可以負向調(diào)節(jié)Warburg效應,二者之間存在著緊密聯(lián)系。我們以WB實驗檢測AMPK在各細胞株的磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)在未照射或者10Gy照后,LLC KO1細胞在24h、48h時AMPKα磷酸化水平都顯著上調(diào),而此現(xiàn)象未出現(xiàn)在RM9細胞中。6.Acsl6 KO增加了γ-H2AX焦點的形成我們以LLC、LLC KO1、RM9、RM9 KO等細胞株為研究對象,行γ-H2AX免疫熒光實驗。Acsl6敲除后使LLC、RM9核內(nèi)γ-H2AX焦點數(shù)目都顯著增加,反映了其DNA損傷修復能力的降低。7.Acsl6 KO通過AMPK-P53通路提高癌細胞內(nèi)P53磷酸化水平及總P53濃度WB結(jié)果顯示,Acsl6敲除后顯著提高了LLC、RM9內(nèi)P53磷酸化水平。IR提高了LLC中P53磷酸化水平,而敲除組細胞中升高更為明顯,P53總量也顯著上升;升高的磷酸化P53均可被ATM抑制劑KU-55933所阻斷,而后者反而增加了AMPK的磷酸化水平。8.Acsl6 KO提高了LLC及RM9細胞內(nèi)的ROS水平ROS檢測發(fā)現(xiàn)LLC KO1和RM9 KO組CM-H2DCFDA波峰發(fā)生了明顯的右偏移,其量化結(jié)果也顯示敲除組細胞內(nèi)ROS水平較WT組顯著增高。9.Acsl6 KO促進了LLC細胞周期G1阻滯細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)敲除Acsl6基因后顯著提高了LLC在IR之后16h、24h及32h的G1周期阻滯水平,而在2h和8h未發(fā)現(xiàn)顯著差異。同時,我們發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并未出現(xiàn)在RM9中。10.Acsl6 KO增加了LLC及RM9的細胞自噬水平首先通過WB檢測了各組細胞IR后LC3Ⅰ-Ⅱ的轉(zhuǎn)化水平。實驗顯示Acsl6 KO提高了兩種細胞的自噬水平,但以LLC更為迅速(IR后24h)。隨后,行AOVs染色對細胞自噬進一步研究,得到了趨勢一致的結(jié)果。11.Acsl6 KO基因回轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建及其放射敏感性研究我們成功構(gòu)建了Acsl6基因敲除回轉(zhuǎn)的LLC KO Rescue2細胞株,行克隆形成實驗,結(jié)果顯示將Acsl6基因回轉(zhuǎn)到敲除細胞株之后,其照后克隆形成能力顯著回升。12.MPLA聯(lián)合敲除Acsl6對LLC放射敏感性的影響以LLC及LLC KO1為研究對象,分別以DMSO、MPLA處理,IR后進行克隆形成實驗,結(jié)果顯示LLC KO1+MPLA組克隆形成能力最弱。研究結(jié)論:基于激活NF-κB而發(fā)揮輻射防護作用的TLRs激動劑在放射生物學領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛重視,同時也是本室長期關(guān)注、重點研究的課題之一。本課題分為兩個部分,分別對MPLA輻射防護作用及ACSL6敲除放射增敏進行了研究:第一部分中,我們首次發(fā)現(xiàn)并證實了新型TLR4激動劑MPLA能夠有效發(fā)揮多器官低毒高效的輻射防護作用,并且較為明晰地揭示了其所依賴的“TLR4-Myd88-MAPK(p38)-NF-κB-糾正TH1/Th2、炎癥因子調(diào)節(jié)”信號通路。此外,我們初步證明了MPLA直接作用于癌細胞不增加其輻射抗性。第二部分中,首次發(fā)現(xiàn)了IR能夠誘發(fā)癌細胞Acsl6基因轉(zhuǎn)錄特異性上調(diào);而敲除該基因之后,顯著增加了癌細胞的放射敏感性;進一步研究發(fā)現(xiàn),ACSL6調(diào)控癌細胞放射敏感性機制與Warburg效應、ROS、自噬、G1阻滯及DNA損傷修復通路等緊密相關(guān);并且,MPLA聯(lián)合敲除ACSL6基因提高腫瘤放療效果展現(xiàn)了良好的前景,提供了諸多新型分子靶點。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R811

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本文編號：2826419