實驗?zāi)康?篩選出在中國華東漢族人群中具有高度信息量的Y-SNP位點,聯(lián)合運用多重PCR技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)、微測序技術(shù),建立Y-SNP分型方法,為特殊的親緣關(guān)系鑒定提供分型平臺,同時探討微測序方法對男女混合DNA樣本檢測的適用性,并累積我國的Y-SNP群體遺傳學(xué)資料。實驗材料:在知情同意的原則下,收集華東漢族無關(guān)男性個體血樣343份,Y-STR有突變的同一父系血樣23對,4℃保存?zhèn)溆�。檢測時取男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948、2800M作為陽性對照,實驗中的混合樣本由男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948和女性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A混合制成。實驗方法:根據(jù)Y染色體系統(tǒng)樹及生物信息數(shù)據(jù)庫(NCBI)中的Y-SNP信息,選擇在東亞人群中具有多態(tài)性的Y-SNP位點71個用于多重PCR技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的分型,從中篩選出在華東男性群體具有中高度信息量的位點近30個,建立多重PCR技術(shù)和SNaPshot分型技術(shù),應(yīng)用于同父系個體(生物學(xué)父子、兄弟、叔侄、爺孫等)的Y-SNP分型,分析其遺傳穩(wěn)定性;另外,為了評估該法用于強(qiáng)奸案檢驗的可能性,對男女混合DNA樣本(按1∶1、1∶4、1∶9、1∶19的比例混合)進(jìn)行了Y-SNP分型,考察男性成分的分型結(jié)果能否不受女性物質(zhì)的干擾。實驗結(jié)果:得到71個Y-SNP位點的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,其中18個位點在華東漢族男性群體具有高度信息量(GD≥0.3),32個位點具有中度信息量(0.2≤GD0.3)。為了使該技術(shù)手段能推廣應(yīng)用于各個法醫(yī)物證學(xué)實驗室,最終選定29個Y-SNP位點,建立了多重PCR技術(shù)和基于微測序原理的SNaPshot分型技術(shù)。這29個位點(rs9785908、rs9786247、rs2267801、rs17269816、rs17276358、rs9786707、rs2032678、rs11096432、rs2032674、rs13447354、rs17276345、rs17842387、rs16980363、rs17269928、rs2032665、rs9306848、rs4589047、rs16980610、rs16980641、rs2075640、rs9306845、rs9786502、rs16980601、rs17174528、rs16980426、rs17316592、rs11096433、rs52812045、rs2075181)均具有較高的多態(tài)性(GD≥0.2),共檢測到64種單倍型.對于日常檢見的Y-STR突變案例(父子、兄弟、叔侄、爺孫等),運用所建立的29個Y-SNP位點的多重PCR擴(kuò)增和SNaPshot分析技術(shù)進(jìn)行檢測,分型結(jié)果均吻合,證明了SNP位點遺傳的穩(wěn)定性。關(guān)于男女混合樣本,在四種混合比例下(1∶1、1∶4、1∶9、1∶19),均能得出男性樣本的分型,且結(jié)果清晰、可靠。結(jié)論:本課題從Y染色體上篩選出了適合華東漢族人群親權(quán)鑒定和個體識別的多態(tài)性Y-SNP位點,并建立了質(zhì)譜分型方法,最終選定29個位點所建立的微測序法適用于法醫(yī)物證學(xué)辦案實際,在某些疑難案件的鑒定中可以發(fā)揮重要作用。同時,本課題所建立的技術(shù)方法還有助于我國DNA數(shù)據(jù)庫的完善和人類學(xué)研究,并能運用于人口遷移進(jìn)化、人口歷史和家系變化等多個研究領(lǐng)域。
【學(xué)位單位】：華東政法大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：D919
【部分圖文】：

在最終選定 29 個中高度信息量 Y-SNP 位點之后，選用 SNaPshot 技術(shù)平試劑盒和遺傳分析儀見圖1、圖2）進(jìn)行分型檢測。SNaPshot 是 種熒光標(biāo)記單堿基延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)的體系內(nèi)加入 ddNTP 雙脫三磷酸，延伸產(chǎn)物的長度僅比延伸引物長度多 1 個 bp，這 1 個 bp 所代表的堿基就變位點的基因型。原理顯示于圖 3。該方法可以同時建立多個 SNP 位點的分析體系，且技術(shù)成熟，數(shù)據(jù)處理簡單快實驗中可實現(xiàn)自動化操作，有利于減少人為影響，在分析大量樣本時具有優(yōu)勢。圖 1 SNaPshot Multiplex Kit圖 2 3130XL 遺傳分析儀

為了篩選出適用于我國華東漢族男性人群個體識別和親權(quán)鑒定的中高度信息-SNP 位點，本著知情同意的原則，收集了華東漢族 343 名無關(guān)男性樣本的血樣（其05 名個體的血樣用于質(zhì)譜平臺，138 名個體的血樣用于 SNaPshot 平臺）。另外，為索其實際應(yīng)用價值，從檢案中挑選出了經(jīng)Y-STR檢測有突變的父系親緣關(guān)系樣本23（三）本課題所使用的檢測方法和平臺首先采用 Agena 公司研發(fā)的 MALDI-TOF MS 檢測平臺從華東漢族男性群體篩選多態(tài)-SNP 位點，在最終選定 29 個中高度信息量 Y-SNP 位點之后，選用 SNaPshot 技術(shù)平臺（試劑盒和遺傳分析儀見圖1、圖2）進(jìn)行分型檢測。

取新 96 孔板，每孔中加入 0.5μL 單堿基延伸純化產(chǎn)物，甲酰胺和 GeneS120 LIZ 按 9∶0.5 的比例混勻配置成 1.5mL 溶液，加在 96 孔板中，每9.5μL，3000r/min 離心 5s，放置于 9700 擴(kuò)增儀進(jìn)行變性，參數(shù)設(shè)置為：95℃ 54℃ 5min，然后用 3130XL 遺傳分析儀進(jìn)行分型檢測。實驗前進(jìn)行光譜校正：首先，將甲酰胺（Hi-Di Formamide+）和 DS-02 MatStandard 按照 19∶1 的比例混勻，放置于 3130XL 遺傳分析儀中。打開電腦中Data Collection Software v3.0 軟件，選擇“Protocol Manager”，在下拉中點擊“新建”，隨后在出現(xiàn)的對話框中依次設(shè)置相應(yīng)選項，將“Dye Set”為 E5，“Polymer”設(shè)為 POP4，“Array Length”為 36，“chemistry”設(shè)為 MatStandard，“Run Module”命名為“SNaPshot DS-02”。隨后點擊“Edit Paramete并輸入相關(guān)參數(shù)。隨后設(shè)置“Run module”，同樣打開軟件，選擇“Module Manage在下拉欄中選擇“新建”，在新對話框中輸入相關(guān)設(shè)置和名稱，點擊“ok”保存隨后點擊左上角運行進(jìn)行光譜校正。校正結(jié)果見圖 4。

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1 宋芳吉,李惠剛;HLA分型方法及其臨床意義[J];生理科學(xué);1988年04期

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本文編號：2820717