X射線屬于電離輻射的一種，在醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，骨科疾病患者常常需要接受多次X射線的照射，而輻照的劑量屬低劑量范圍以內(nèi)。低劑量X線輻照離體成骨母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程，從而加速骨折愈合，但其具體機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究使用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)低劑量X線照射會(huì)促進(jìn)與細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)，可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)-局部粘附-細(xì)胞骨架途徑參與低劑量X線照射促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程。 目前，有關(guān)低劑量X線照射對(duì)成骨細(xì)胞骨架的研究還比較少。低劑量X線照射成骨細(xì)胞后，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化情況及機(jī)制尚不明了。本研究采用醫(yī)用直線加速器對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行0Gy(對(duì)照組)、0.5Gy（低劑量組）、5Gy（高劑量組） X線照射，觀察成骨細(xì)胞在X線照射后細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動(dòng)蛋白的變化，通過(guò)Real-TimePCR及Westtern blot技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)RhoA/ROCK、cofilin及其磷酸化水平變化，探討低劑量X線照射參與成骨前體細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制，以及細(xì)胞骨架重構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的影響，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)低劑量電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為三部分： 實(shí)驗(yàn)一：不同劑量X線照射對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響 目的：觀察不同劑量X線照射作用于成骨細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動(dòng)蛋白的變化情況，為進(jìn)一步研究低劑量X線照射引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得MC3T3-E1細(xì)胞，采用醫(yī)用直線加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy（劑量率為200cGy／min）作用成骨細(xì)胞后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)變化以及FITC-phalloidin對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。 結(jié)果：0.5Gy、5Gy組細(xì)胞的F-actin在照射后2h后遭到破壞，且隨著輻射劑量的增加破壞程度越嚴(yán)重，呈劑量依賴性。但24h后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重構(gòu)， F-actin染 色逐漸增強(qiáng)、纖維增粗，照射后第3天時(shí)最為顯著，但至第5天時(shí)F-actin染色逐漸恢復(fù)正常，與0Gy組接近。 結(jié)論：X線輻射短時(shí)間內(nèi)能使成骨前體細(xì)胞骨架破壞、F-actin解聚，但隨后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重構(gòu)，F(xiàn)-actin表達(dá)增強(qiáng)，至第5d時(shí)逐漸恢復(fù)正常。 實(shí)驗(yàn)二：RhoA/ROCK信號(hào)通路在介導(dǎo)低劑量X線照射引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)中的研究 目的：研究RhoA/ROCK信號(hào)通路在低劑量X線照射引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)中的作用。 方法：采用醫(yī)用直線加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy作用成骨細(xì)胞后，以Real-TimePCR及Westtern blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RhoA、 ROCK、 cofilin及磷酸化cofilin（phospho-cofilin）水平變化。隨后以ROCK激酶特異性抑制劑Y27632預(yù)處理成骨細(xì)胞，觀察X線照射后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架變化情況。 結(jié)果：成骨細(xì)胞經(jīng)0.5、5Gy X線照射后1天，各實(shí)驗(yàn)組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量開(kāi)始升高，第3天變化最為明顯，直至5天后各實(shí)驗(yàn)組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量趨于下降。Y27632預(yù)處理組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架遭到破壞，肌動(dòng)蛋白纖維排列稀疏紊亂，阻斷了低劑量X線照射引起的細(xì)胞骨架重構(gòu)。 結(jié)論：低劑量X線照射可以通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)三：抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)對(duì)低劑量X線作用下成骨細(xì)胞增殖分化的影響 目的：研究RhoA/ROCK信號(hào)通路在低劑量X線照射促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的作用。 方法：在對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行低劑量X線照射前，使用ROCK激酶特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞，隨后以CCK-8、ALP活性檢測(cè)、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Western blot技術(shù)檢測(cè)經(jīng)0.5GyX線照射后成骨細(xì)胞的增殖、分化情況。 結(jié)果：使用ROCK激酶抑制劑Y27632處理細(xì)胞后可以阻斷低劑量X線照射促成骨細(xì)胞增殖、分化作用。+Y276320.5Gy組細(xì)胞各項(xiàng)成骨分化指標(biāo)降低，與0Gy組相比無(wú)明顯差異。 結(jié)論：RhoA/ROCK信號(hào)通路參與低劑量X線照射促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R814.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820427