人體進(jìn)行力竭運(yùn)動時,會產(chǎn)生大量氧自由基,導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和線粒體功能紊亂。因此,研究運(yùn)動氧化應(yīng)激致心肌線粒體功能調(diào)控對預(yù)防運(yùn)動性心肌損傷非常重要。S100A1是一種鈣結(jié)合蛋白,具有提高心肌收縮力,調(diào)節(jié)血管功能,刺激ATP合成酶活性等作用,與腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ANT)結(jié)合,影響線粒體的代謝及凋亡等。但運(yùn)動氧化應(yīng)激致心肌損傷后S100A1是否通過ANT調(diào)控心肌線粒體功能尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過建立運(yùn)動氧化應(yīng)激損傷動物模型和離體心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,研究S100A1和ANT蛋白在心肌組織中的表達(dá)和線粒體的功能變化;采用外源性S100A1干預(yù)和敲除S100A1基因研究S100A1對氧化應(yīng)激心肌線粒體功能的影響及調(diào)控,初步闡釋其對氧化應(yīng)激心肌線粒體功能調(diào)控機(jī)制,為建立運(yùn)動性心肌損傷防護(hù)開辟新思路。主要研究結(jié)果如下:1、S100A1和ANT蛋白在不同大鼠心肌組織中的表達(dá)變化以雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,隨機(jī)分為力竭運(yùn)動損傷組(Exhaustion exercise injury,EI)和正常對照組(Normal Control,NC),對EI組進(jìn)行為期10天的連續(xù)力竭運(yùn)動訓(xùn)練。待訓(xùn)練結(jié)束以后,即刻取大鼠血液和心肌組織,分別進(jìn)行生化和病理指標(biāo)檢測。結(jié)果表明:力竭運(yùn)動后,ROS活性和CK活性顯著高于對照組;SOD活性和GSH-PX含量顯著低于對照組。提示,大鼠力竭運(yùn)動會導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,機(jī)體抗氧化能力降低。HE結(jié)果表明,力竭運(yùn)動會導(dǎo)致大鼠心肌組織呈現(xiàn)空泡變性、心肌間質(zhì)水腫等病理變化。電鏡發(fā)現(xiàn),對照組心肌組織毛細(xì)血管通暢,心肌纖維排列整齊,線粒體結(jié)構(gòu)致密,心肌間質(zhì)無明顯滲出。運(yùn)動損傷后,大鼠心肌組織間質(zhì)滲出明顯,毛細(xì)血管擴(kuò)張,部分心肌細(xì)胞破裂,線粒體輕度腫大,心肌纖維及嵴不同程度斷裂,可見局灶性壞死。免疫組化顯示,正常心肌組織中,S100A1和ANT蛋白均勻分布,而損傷心肌組織中S100A1和ANT蛋白明顯減少。Western-Blot結(jié)果表明,與對照組相比,損傷心肌組織中的S100A1和ANT蛋白表達(dá)水平降低。2、S100A1蛋白對氧化應(yīng)激損傷心肌線粒體功能的影響及調(diào)控采用大鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對象,以1 mM的H_2O_2干預(yù)12 h,成功建立大鼠H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。結(jié)果表明,H_2O_2可誘導(dǎo)大鼠H9c2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致大鼠H9c2心肌細(xì)胞存活率降低,并伴有部分H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。外源性S100A1蛋白干預(yù)后,H9c2心肌細(xì)胞存活率升高。這提示,S100A1蛋白具有降低H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞凋亡的作用。RT-PCR結(jié)果表明,氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞中S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的mRNA含量顯著降低,外源性S100A1蛋白干預(yù)后,ANT、PGC-1α、Tfam的mRNA含量顯著升高。Western-Blot結(jié)果表明,氧化損傷后,心肌細(xì)胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam蛋白表達(dá)降低。S100A1蛋白干預(yù)后,心肌細(xì)胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam蛋白含量表達(dá)升高。為了研究S100A1對氧化應(yīng)激損傷心肌線粒體功能的影響及調(diào)控,我們采用Si-RNAS100A1技術(shù),使心肌細(xì)胞S100A1基因沉默,RT-PCR和Western-Blot結(jié)果顯示,敲除S100A1后,心肌細(xì)胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表達(dá)降低。提示,S100A1蛋白可能是通過與ANT的相互作用,進(jìn)而影響PGC-1α及核轉(zhuǎn)錄因子Tfam的表達(dá),發(fā)揮對損傷心肌線粒體功能的影響及調(diào)控作用。綜上所述,力竭運(yùn)動可致大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能紊亂,S100A1和ANT蛋白在力竭運(yùn)動氧化應(yīng)激損傷大鼠心肌組織中表達(dá)降低。建立了H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,給予外源性S100A1蛋白后,H9c2心肌細(xì)胞存活率升高,同時ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表達(dá)水平升高。敲除S100A1后,H9c2心肌細(xì)胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表達(dá)水平降低。提示,S100A1蛋白對氧化應(yīng)激損傷心肌線粒體功能的影響及調(diào)控,可能是通過S100A1蛋白與線粒體靶標(biāo)ANT相互作用,介導(dǎo)胞漿ADP和線粒體ATP的交換。ANT蛋白具有促進(jìn)PGC-1α功能的作用。PGC-1α含量的升高,同時會伴有核轉(zhuǎn)錄因子Tfam的表達(dá)增加,進(jìn)而促進(jìn)線粒體功能改善,這可能是S100A1蛋白對氧化應(yīng)激損傷心肌線粒體功能的調(diào)控機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：天津理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R87
【部分圖文】：

圖 1.1 S100 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[29]Figure 1.1 The schematic diagram of the structure of S100 protein.2 S100A1 調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞 Ca2+的平衡受損的肌質(zhì)網(wǎng)（SR）鈣穩(wěn)態(tài)的出現(xiàn)成為了人類心力衰竭（HF）的重要標(biāo)志。研現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生心力衰竭時，心臟中的 S100A1 表達(dá)水平降低，首先確認(rèn)為 S100與心肌肌肉收縮。且 S100A1 可以同結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合物以微摩爾相互結(jié)合。NMR [19]顯示該肽結(jié)合在 S100A1 的鈣離子（Ca2+）依賴性疏水間隙內(nèi)。S100A1 在骨骼肌收縮耦合中起主要作用，通過與蘭諾定受體（RyR）的結(jié)構(gòu)域的特異性相互作用進(jìn)表明可以使用 S100A1 作為治療心臟和骨骼肌病的潛在手段。在非心臟細(xì)胞類型和分離的 SR 囊泡中，S100A1/SERCA2a 共沉淀研究表明 S100 SERCA2a 的結(jié)合導(dǎo)致酶的活性增加，肌質(zhì)網(wǎng)狀（SR）Ca2+的攝取提高，（SR）C荷增強(qiáng)[23,24]。在 SERCA2a 含量減少的人的衰竭心肌細(xì)胞中，通過使用腺病毒載體轉(zhuǎn)染的 S100

圖 1.2 A S100A1 對心肌胞內(nèi) Ca2+的調(diào)節(jié)及相互聯(lián)系；B 心肌細(xì)胞中 S100A1 靶向結(jié)構(gòu)示意圖[33]Figure 1.2 A The regulation and interrelation of S100A1 on the intracellular Ca2+in the myocardiumB The schematic diagram of the target structure of S100A1 in cardiac myocytes用 β-腎上腺素處理去除 Ca2+的細(xì)胞質(zhì)和 SR 后，其細(xì)胞質(zhì) Ca2+和肌質(zhì)網(wǎng) Ca2+負(fù)荷強(qiáng)，表明 S100A1 不僅表現(xiàn)出部分 β-腎上腺素的功能，而且還具有提高部分 β-腎上腺的功能，增加 RyR2 舒張功能從而降低心律失常[26]。這說明 S100A1 最有可能在 cAM依賴性蛋白激酶 A 和 Ca2+/CaM 鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶 II 的下游獨(dú)立作用[27]。為了闡明 S100A1 在心臟和骨骼肌中的功能，多個研究已經(jīng)證明去除 S100A1 之后由于受到功能性受損的蘭諾定受體（RyR）的影響導(dǎo)致了肌細(xì)胞的分裂減少。通過測肌質(zhì)網(wǎng)囊泡和色氨酸熒光實(shí)驗(yàn)，還確定完整的蘭諾定受體的細(xì)胞質(zhì)上有一個與 S100A新的結(jié)合位點(diǎn)，并對應(yīng)于確定的鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。S100A1 與蘭諾定受體（RyR）磷蛋白/肌質(zhì)網(wǎng)（SR）Ca2+-ATPase 復(fù)合物相互作用，并且可能通過與這些蛋白質(zhì)的相作用調(diào)節(jié) Ca2+循環(huán)，導(dǎo)致更快和更穩(wěn)定的肌細(xì)胞收縮。RyR2 屬于 RyR 基因家族中的一種，集中分布在心肌細(xì)胞質(zhì)膜且靠近于 T 管的內(nèi)部部位，在空間結(jié)構(gòu)上和 L 型 Ca2+通道緊密相連的 Ca2+釋放通道受體[28]。

ven T. Pleger, David M. Harris 等[31]通過利用 S100A1 敲除小鼠（SKO）與）小鼠來研究內(nèi)源性 S100A1 在內(nèi)皮細(xì)胞中的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中的A1 蛋白積極參與血管調(diào)節(jié)功能，其中 S100A1 敲除小鼠（SKO）的血壓比）小鼠的血壓高 24.1 %，同時與野生型相比，來自 S100A1 敲除小鼠（SK脈對于乙酰膽堿的響應(yīng)顯著降低，進(jìn)一步說明 eNOS 的活化降低。S100ASKO）中受損的內(nèi)皮性 NO 產(chǎn)生可以部分歸因于內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中激動劑]i 減少。因此，內(nèi)皮型 NO 合酶(nitric oxide synthase，NOS)可促進(jìn)血管內(nèi)皮 穩(wěn)定釋放，而 S100A1 蛋白可通過調(diào)控 Ca2+和蛋白激酶 C 等途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮性，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞中 NO 的穩(wěn)定。因此，S100A1 蛋白在改善血管疾中的內(nèi)皮功能障礙過程中成為一種新型的治療手段。體血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏 S100A1 表現(xiàn)出對 VEGF 和缺氧導(dǎo)致的 NO 減少，并減少，遷移率降低和毛細(xì)血管形成受損。隨后的生物化學(xué)分析中，VEGF乏 S100A1 的內(nèi)皮細(xì)胞中抑制 eNOS Thr495 位點(diǎn)的過度磷酸化，進(jìn)一步研eNOS Thr495 的磷酸化依賴于 PKC 活性的提高。S100A1 通過提高細(xì)胞內(nèi)度，形成 Ca/CaM 復(fù)合物與 eNOS 結(jié)合，與 Ca2+靶向結(jié)合和對 PKC 依賴性 eNOS 相互作用已被證明是對局部缺血性血管生成反應(yīng)不可或缺的先決條

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本文編號：2819716