【摘要】：減壓病(decompression sickness,DCS)是威脅潛水等高氣壓作業(yè)和航空航天等活動安全的關(guān)鍵醫(yī)學(xué)問題,快速減壓過程和減壓后惰性氣體過飽和生成的氣泡是引起DCS發(fā)病的根本原因。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,氣泡的機(jī)械作用,如栓塞作用、剪切力作用、機(jī)械壓迫作用是導(dǎo)致DCS形成的根本原因。隨著研究的深入,越來越多的證據(jù)表明氣泡作為外源性物質(zhì)可觸發(fā)體內(nèi)一系列生化及炎癥反應(yīng),如血小板聚集、白細(xì)胞激活、細(xì)胞因子釋放等,誘發(fā)血管內(nèi)凝血及炎癥反應(yīng),導(dǎo)致血栓形成,組織缺血水腫,炎細(xì)胞滲出,這可能在DCS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用。微粒(microparticles,MPs)是細(xì)胞在激活或凋亡早期以出芽方式分泌的直徑約0.1~1μm不規(guī)則囊性小泡。MPs表面可攜帶母細(xì)胞表面抗原,其內(nèi)容物含有濃集細(xì)胞因子、信號蛋白、mRNA和microRNA。作為細(xì)胞間生物信號和信息傳遞的載體,MPs可將其胞內(nèi)成分轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞,介導(dǎo)靶細(xì)胞活化、表型修飾、及功能調(diào)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞來源的MPs,即內(nèi)皮微粒(endothelial microparticles,EMPs)不僅是內(nèi)皮損傷的重要指標(biāo),在介導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙中同樣發(fā)揮顯著的致病作用。EMPs在血管炎癥、血管舒縮功能、血管生成等方面發(fā)揮多重作用。諸多生理及病理因素均可激活或損傷內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致EMPs的產(chǎn)生與釋放。Madden等研究發(fā)現(xiàn),潛水員完成潛水作業(yè)返回水面后,循環(huán)中EMPs數(shù)量顯著增加,提示血管內(nèi)皮功能損傷。Thom等通過一系列人體試驗發(fā)現(xiàn),潛水員經(jīng)不同方案潛水后,循環(huán)MPs數(shù)量和多普勒超聲檢測的血管內(nèi)氣泡信號強(qiáng)度呈正相關(guān);小鼠經(jīng)模擬潛水后快速減壓,循環(huán)血液中各亞型MPs的數(shù)量均顯著增加,并通過激活血小板和中性粒細(xì)胞增加血管內(nèi)白細(xì)胞粘附,進(jìn)一步加重DCS血管炎性損傷,甚至可導(dǎo)致DCS中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。如提前給予MPs消融劑聚乙二醇,則可顯著降低DCS所致血管炎性損傷。上述研究結(jié)果表明MPs可能在DCS血管炎性損傷中發(fā)揮重要的致病作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),大鼠模擬潛水后快速減壓,循環(huán)內(nèi)EMPs顯著增加,同時伴有腦、骨骼肌和大網(wǎng)膜中中性粒細(xì)胞顯著滯留現(xiàn)象,提示廣泛的血管炎癥反應(yīng);如在潛水前給予內(nèi)皮保護(hù)劑辛伐他汀后,可顯著降低DCS發(fā)病率,減輕肺組織炎性損傷,同時循環(huán)內(nèi)EMPs數(shù)量增幅顯著下降,各組織器官中性粒細(xì)胞滯留程度顯著下降。因此,我們推測在DCS的發(fā)病過程中,氣泡通過直接觸碰或改變血液層流剪切力,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活或損傷,產(chǎn)生和釋放EMPs并進(jìn)一步誘發(fā)血管炎癥損傷級聯(lián)放大效應(yīng)。為觀察DCS氣泡誘導(dǎo)的EMPs在血管炎性損傷中的確切效應(yīng),我們通過自制的微氣泡生成裝置模擬DCS氣泡對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用,檢測氣泡刺激后培養(yǎng)液中EMPs生成數(shù)量的情況,判斷血管內(nèi)皮損傷的程度;在細(xì)胞及動物水平分別觀察氣泡刺激誘導(dǎo)的EMPs對血管內(nèi)皮的損傷效應(yīng)(第一部分)。在明確氣泡刺激可顯著促進(jìn)EMPs的產(chǎn)生與釋放并進(jìn)一步對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷效應(yīng)后,本課題組進(jìn)一步探索氣泡誘導(dǎo)EMPs產(chǎn)生的分子機(jī)制,尋找其中的關(guān)鍵信號分子,從而為DCS的防治尋找新方法與新思路(第二部分)。此外,針對DCS致病的根本原因——氣泡,尋找促進(jìn)氣體交換、減少氣泡生成的方法,為DCS的防治尋找新的的非加壓治療手段。第一部分:氣泡誘導(dǎo)的內(nèi)皮微粒對內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究研究方法:本研究以原代培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)為研究對象,通過自制的氣泡發(fā)生裝置,將氣泡與PMVECs接觸30 min后,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,后收集培養(yǎng)液。4~oC,10000 g×30 min離心,去除細(xì)胞碎片,收集上清;4 ~oC,100000 g×60min離心,棄去上清。1×PBS重懸,流式細(xì)胞法檢測EMPs的數(shù)量。在明確氣泡刺激誘導(dǎo)EMPs產(chǎn)生與分泌的效應(yīng)后,將氣泡誘導(dǎo)的EMPs與正常PMVECs共孵育或經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi),在體與離體條件下分別觀察內(nèi)皮損傷相關(guān)指標(biāo)的變化情況。此外,將EMPs與含氟表面活性劑FSN-100共孵育,觀察FSN-100對EMPs的消融作用。研究結(jié)果:本課題組成功分離與培養(yǎng)出純度大于95%的大鼠PMVECs并用于后續(xù)實驗。流式結(jié)果顯示氣泡刺激可顯著促進(jìn)EMPs的產(chǎn)生與釋放,將氣泡誘導(dǎo)的EMPs與正常PMVECs共孵育后,內(nèi)皮細(xì)胞活性顯著下降(存活率下降,凋亡率上升)。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生與分泌細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)和血管內(nèi)皮粘附分子(VCAM-1)顯著增加,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加、一氧化氮合成(NO)減少,細(xì)胞間緊密連接下降,內(nèi)皮通透性增加。在體實驗中,大鼠循環(huán)內(nèi)皮損傷指標(biāo)可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(s-TM)及粘附分子ICAM-1和VCAM-1含量顯著增高,提示內(nèi)皮廣泛而嚴(yán)重的損傷。FSN-100可顯著減輕氣泡誘導(dǎo)的EMPs對內(nèi)皮的不良效應(yīng)。結(jié)論:氣泡刺激可顯著促進(jìn)EMPs的產(chǎn)生與釋放且氣泡誘導(dǎo)的EMPs可進(jìn)一步促進(jìn)血管功能障礙及炎性損傷。第二部分:氣泡誘導(dǎo)內(nèi)皮微粒產(chǎn)生的機(jī)制研究研究方法:本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為研究對象,氣泡誘導(dǎo)EMPs產(chǎn)生的方法同“第一部分”。應(yīng)用熒光探針或流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測氣泡刺激后胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的變化并利用Ca~(2+)通道阻滯劑LaCl_3(100μM)觀察胞內(nèi)Ca~(2+)對氣泡誘導(dǎo)EMPs產(chǎn)生的影響。此外,流式法檢測氣泡刺激后胞膜翻轉(zhuǎn)酶Flippase活性的變化及磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)外露的情況,并進(jìn)一步分析Ca~(2+)是否在其中發(fā)揮作用;利用熒光顯微鏡觀察骨架蛋白F-actin在胞膜共定位情況并進(jìn)一步分析Ca~(2+)是否在其中發(fā)揮調(diào)控作用。Western blot法分別檢測誘導(dǎo)骨架蛋白重構(gòu)的重要信號分子——細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2),肌球蛋白輕鏈(MLC)激活情況并進(jìn)一步利用相應(yīng)的分子抑制劑明確其在誘導(dǎo)EMPs釋放中的確切作用。研究結(jié)果:內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)氣泡刺激后,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度顯著增高,且氣泡誘導(dǎo)EMPs的數(shù)量與胞內(nèi)Ca~(2+)濃度具有明顯的正相關(guān)性(r=0.687,P0.05)。氣泡刺激內(nèi)皮細(xì)胞后,p-ERK1/2,p-MLC水平明顯上升(P0.05,P0.05),細(xì)胞膜骨架蛋白共定位顯著減少、骨架蛋白重構(gòu)增加(P0.05)。應(yīng)用ROCK抑制劑Y27632后,p-MLC水平被顯著抑制,骨架蛋白重構(gòu)減少,同時氣泡誘導(dǎo)EMPs釋放的數(shù)量顯著降低(P0.05)。氣泡刺激后,內(nèi)皮細(xì)胞翻轉(zhuǎn)酶Flippase活性明顯下降,胞膜PS外露顯著增加。應(yīng)用Ca~(2+)通道阻滯劑后可顯著減輕上述效應(yīng)中除ERK1/2被激活之外的所有作用。結(jié)論:氣泡刺激血管內(nèi)皮后通過觸發(fā)胞內(nèi)Ca~(2+)增加激活Rho/ROCK通路并引起細(xì)胞膜骨架蛋白共定位減少、骨架蛋白重構(gòu),同時抑制翻轉(zhuǎn)酶Flippase活性導(dǎo)致PS外露增加,促進(jìn)EMPs的產(chǎn)生與釋放。第三部分:肺表面活性物質(zhì)對大鼠減壓病的保護(hù)作用研究研究方法:實驗前12 h給予大鼠霧化吸入10 mg肺表面活性物質(zhì)(Surfactant)或生理鹽水(Saline),然后建立DCS模型(空氣模擬潛水:60 m水深,90 min高壓暴露,3 min勻速減至常壓)。觀察大鼠DCS發(fā)病并探測血管內(nèi)氣泡生成情況,檢測大鼠內(nèi)皮炎癥及氧化損傷相關(guān)指標(biāo)。研究結(jié)果:霧化吸入Surfactant可顯著降低大鼠DCS發(fā)病率及死亡率(75.0%vs.46.4%,P0.01;28.6%vs.14.3%,P0.01),DCS發(fā)病潛伏期和生存期明顯延長(P0.05)。血管內(nèi)氣泡生成量顯著下降(P0.01)。大鼠全身性炎癥及肺內(nèi)炎癥指標(biāo)(白介素1β和白介素6)較Saline組明顯降低(P0.01),內(nèi)皮損傷相關(guān)指標(biāo)(肺W/D,肺泡灌洗液蛋白,E-選擇素,ICAM-1,EMPs)較Saline組明顯降低(P0.05),氧化與抗氧化(GSH/GSSG)失衡顯著改善(P0.01)。結(jié)論:霧化吸入Surfactant可通過抑制肺內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善肺功能、促進(jìn)惰性氣體排出明顯減少血管內(nèi)氣泡生成;輔以抗氧化及保護(hù)內(nèi)皮作用預(yù)防大鼠DCS的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R845.21
【圖文】：

氣泡誘導(dǎo)的內(nèi)皮微粒在減壓病血管炎性損傷中的）。內(nèi)皮細(xì)胞用其特異性標(biāo)記物 VIII 因子相關(guān)抗原（ 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核染色視野，并在每個視野中計數(shù) 100 個細(xì)胞，計算 VII結(jié)果表明 PMVECs 純度達(dá) 95%以上，為后續(xù)實驗功構(gòu)建了氣泡刺激內(nèi)皮細(xì)胞體外模型。如圖 1-1B 所置相結(jié)合的方法，達(dá)到模擬 DCS 發(fā)生后氣泡觸碰血

1-2 氣泡刺激誘導(dǎo) EMPs 產(chǎn)生與釋放及 EMPs 消融著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生與分泌 EMPs；FSN-100 可有效效果越好。n=3，*P<0.01。泡誘導(dǎo)的 EMPs 對內(nèi)皮活性的影響的EMPs與正常內(nèi)皮共培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞存活率下降Ps，P<0.05）；此外，細(xì)胞凋亡率顯著增加（圖 1-3B EMPs 與含氟表面活性劑 FSN-100 共孵育能夠有效

（三）氣泡誘導(dǎo)的 EMPs 對內(nèi)皮活性的影響將氣泡誘導(dǎo)的EMPs與正常內(nèi)皮共培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞存活率下降至86%（圖1-3A，正常對照 vs. EMPs，P<0.05）；此外，細(xì)胞凋亡率顯著增加（圖 1-3B，2.4% vs. 7.2%，P<0.05）。提前將 EMPs 與含氟表面活性劑 FSN-100 共孵育能夠有效地逆轉(zhuǎn)氣泡誘導(dǎo)

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本文編號：2799106