【摘要】：研究背景和目的:力學(xué)刺激同生物化學(xué)刺激均在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)各種胞內(nèi)信號(hào)。目前,力學(xué)生物學(xué)成為研究流體靜水壓、壓縮應(yīng)力和拉伸應(yīng)力等力學(xué)刺激對(duì)生物體影響的重要手段之一。力學(xué)刺激在骨重塑中起著重要作用。骨組織細(xì)胞在體內(nèi)的應(yīng)力作用下分化、增殖并成熟,并對(duì)應(yīng)力刺激極為敏感。體外培養(yǎng)的工程骨組織往往不能提供足夠的組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能,這在很大程度上歸因于細(xì)胞培養(yǎng)過程中缺乏力學(xué)載荷的刺激。近幾十年來,我國(guó)在航空航天領(lǐng)域取得了巨大的成就,空間探索、科研活動(dòng)、飛行訓(xùn)練活動(dòng)日益頻繁,重力場(chǎng)(微重力、超重)的改變對(duì)骨組織代謝影響的研究也越來越受到關(guān)注。由于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器,如細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞骨架(包括肌動(dòng)蛋白纖維、中間絲和微管)等均有不同的密度,重力的改變可引起它們相對(duì)位置的改變。研究表明,重力場(chǎng)的變化對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能均產(chǎn)生各種影響。一般來說,微重力的暴露可抑制骨質(zhì)的生成。雖然超重可以通過體外高速離心的方式實(shí)現(xiàn),但目前為止,關(guān)于高重力(高G)環(huán)境對(duì)骨組織細(xì)胞影響的相關(guān)研究卻相當(dāng)有限。最新的研究表明,超重可觸發(fā)復(fù)雜的力學(xué)傳導(dǎo)途徑,在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生重要的調(diào)節(jié)作用。然而,超重對(duì)成骨細(xì)胞影響的確切力學(xué)生物學(xué)機(jī)制還有待深入研究。本文主要采用力學(xué)生物學(xué)方法探討高重力(超重)的極端力學(xué)環(huán)境下成骨細(xì)胞如何響應(yīng),分子水平如何變化,成骨細(xì)胞損傷、重建的過程和機(jī)理如何,為極端力學(xué)環(huán)境下骨組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、重建和適應(yīng)性變化的研究提供理論基礎(chǔ)。該研究是對(duì)生理載荷環(huán)境下骨組織/細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、重建和適應(yīng)性變化研究工作的延伸,從而發(fā)展生物力學(xué)和力學(xué)生物學(xué)的新理論、新方法和新技術(shù),拓展生物力學(xué)研究的新領(lǐng)域。研究方法:1高加速度離心式加載裝置構(gòu)建小鼠MC3T3-E1細(xì)胞高重力模型,加速度分別為1 g、5 g、10 g、20 g、40 g,1天1次,每次30 min,共3天;2小鼠MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)高重力暴露后,應(yīng)用HE染色、透射電鏡及鬼筆環(huán)肽染色分別觀察MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞微絲骨架的變化;3小鼠MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)高重力暴露后,應(yīng)用Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)高重力對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和凋亡的影響;qPCR及western blot檢測(cè)高重力對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)及活性的影響;4采用小鼠lncRNA表達(dá)譜及mRNA表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)基因及共同差異LncRNA及mRNA表達(dá)基因,構(gòu)建高重力環(huán)境下影響成骨細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控圖,篩選最相關(guān)的信號(hào)通路和信號(hào)分子,進(jìn)一步研究候選基因的功能及其調(diào)控機(jī)制;5運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tag,TMT)標(biāo)記的蛋白組學(xué)定量技術(shù)、聯(lián)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析,研究高重力加載前后MC3T3-E1細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,篩選差異表達(dá)的蛋白,力學(xué)生物學(xué)及分子生物學(xué)方法進(jìn)一步研究重點(diǎn)蛋白質(zhì)的功能;多組學(xué)聯(lián)合關(guān)聯(lián)分析轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)等多方面信息,深入探討高重力在骨重建中的作用及其作用機(jī)制。結(jié)果:1小鼠MC3T3-E1細(xì)胞在正常1 g環(huán)境下,培養(yǎng)早期,細(xì)胞以梭形為主,細(xì)胞突起明顯,細(xì)胞與細(xì)胞之間通過突起相連接,主要呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞類型;培育晚期,細(xì)胞以立方形為主,細(xì)胞與細(xì)胞之間連接成片,排列成鋪路石狀,主要呈現(xiàn)上皮細(xì)胞類型。小鼠MC3T3-E1細(xì)胞在高重力環(huán)境下,隨著重力加速度的不斷增加(5 g、10 g、20 g、40 g)以及培養(yǎng)時(shí)間的逐漸增長(zhǎng)(24 h、48 h、72 h),小鼠MC3T3-E1細(xì)胞輪廓逐漸變圓;細(xì)胞內(nèi)部微絲肌動(dòng)蛋白纖維增粗,細(xì)胞體積增大,輪廓變圓,與光鏡下結(jié)果一致;細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及其線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變。2高重力的極端力學(xué)環(huán)境下,小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生改變。低水平(5 g)的高重力暴露,小鼠MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性開始升高;中水平(10g和20 g)的高重力暴露,成骨細(xì)胞增殖活性顯著升高;高水平的(40 g)高重力暴露,成骨細(xì)胞的增殖活性則受到抑制。低水平(5 g)的高重力刺激對(duì)成骨細(xì)胞凋亡無明顯作用;中水平(10 g和20 g)的高重力刺激可引起成骨細(xì)胞輕度凋亡;高水平(40 g)的高重力刺激,對(duì)成骨細(xì)胞造成損害,引起成骨細(xì)胞的大量凋亡。低、中水平(5 g、10 g和20 g)的高重力刺激均能促進(jìn)小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表達(dá),其中,當(dāng)重力加速度為10 g和20 g時(shí),促分化作用最為明顯。高水平(40 g)的高重力刺激下,小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表達(dá)下降。3芯片共檢測(cè)了58,809小鼠lncRNAs和39,027小鼠mRNAs,超重環(huán)境下,大量的lncRNA和mRNA均發(fā)生改變,且隨著重力加速度的增加,差異表達(dá)的lncRNA和mRNA也越來越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差異表達(dá)的lncRNAs有193個(gè),mRNAs有35個(gè),其中上調(diào)的有28個(gè)lncRNAs和6個(gè)mRNAs,下調(diào)的有165個(gè)lncRNAs和29個(gè)mRNAs。通過生物信息學(xué)分析了潛在的調(diào)控機(jī)制并進(jìn)一步預(yù)測(cè)了差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs之間的相互作用關(guān)系,通過mRNAs-lncRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定了超重環(huán)境中參與骨重建的核心調(diào)控因子。結(jié)合表達(dá)譜芯片檢測(cè)以及生物信息學(xué)分析結(jié)果,將lncRNA NONMMUT012703確定為高重力敏感、骨重建相關(guān)的lncRNA目標(biāo)分子進(jìn)行功能學(xué)研究。4通過TMT相對(duì)定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)超重環(huán)境下,大量蛋白發(fā)生變化。隨著重力加速度的增加,差異表達(dá)的蛋白也越來越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差異表達(dá)的蛋白有24個(gè),其中上調(diào)的有22個(gè),下調(diào)的有2個(gè)。通過生物信息學(xué)分析了潛在的調(diào)控機(jī)制并預(yù)測(cè)了差異表達(dá)蛋白之間的互作關(guān)系,進(jìn)一步研究重點(diǎn)蛋白質(zhì)的功能。5針對(duì)非編碼RNA(lncRNAs)表達(dá)譜、編碼RNA(mRNAs)表達(dá)譜和蛋白表達(dá)譜,多組學(xué)聯(lián)合關(guān)聯(lián)分析轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)等多方面信息,深入探討高重力在骨重建中的作用及其機(jī)制。生物信息學(xué)及后續(xù)的相關(guān)研究結(jié)果預(yù)測(cè),NONMMUT012703作為高重力敏感、骨重建相關(guān)的候選lncRNA,可能與靶基因(如CFTR,NFATC2,SYCN,SOCS3,GIP,SNHG7OS和VMN2R90)相互作用,或與轉(zhuǎn)錄因子(c-Rel、HNF-3beta、E47、HLF、RFX1和COMP1)結(jié)合,通過多條信號(hào)通路(如MAPK、Jak-STAT、cGMP-PKG、Wnt、PI3K-Ak和VEGF信號(hào)通路等)之間的串話作用,共同參與超重環(huán)境下的骨重建過程。結(jié)論:1課題組自主研發(fā)的高加速度離心式加載裝置可良好的模擬超重環(huán)境,適用于超重環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)的研究。2小鼠MC3T3-E1細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性,力學(xué)刺激下具有良好的生物學(xué)響應(yīng),是研究力學(xué)作用下成骨細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的良好模型。3成骨細(xì)胞在高重力環(huán)境下,為對(duì)抗力學(xué)刺激,細(xì)胞形態(tài)、微絲骨架及超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變。4高重力的極端力學(xué)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生很大的影響。超重對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響取決于重力加速度的大小。重力加速度20 g以下為細(xì)胞安全加載范圍,不會(huì)引起成骨細(xì)胞的大量凋亡。中水平(10 g和20 g)的高G刺激,小鼠成骨細(xì)胞生物學(xué)行為變化最為顯著。5高重力的極端力學(xué)環(huán)境下,小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的非編碼RNA(lncRNAs)譜、編碼RNA(mRNAs)譜及蛋白的表達(dá)譜均發(fā)生改變,且隨著重力加速度的增加,差異變化的基因和蛋白也逐漸增多。6重力場(chǎng)變化情況下獲得的在成骨分化過程中具有差異表達(dá)的lncRNA可能是骨組織損傷、修復(fù)與重建過程中的潛在靶標(biāo)。7成骨細(xì)胞受到超重暴露后差異表達(dá)的蛋白可能是重力敏感、骨重建相關(guān)的生物標(biāo)志蛋白。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R85
【圖文】：

圖 1-1 骨的結(jié)構(gòu)與力學(xué)適應(yīng)性長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過 200個(gè)核苷酸（nt）的 RNA，不具有長(zhǎng)可讀框且無編碼蛋白功能。在不同的組織之間lncRNA 表達(dá)量不同，且同一組織在不同生長(zhǎng)階段 lncRNA 表達(dá)量也存在差異[24]。lncRNA 與 mRNA 作為轉(zhuǎn)錄本，有很多相似之處，他們均在 RNA 聚合酶Ⅱ的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后可進(jìn)行剪切，并且 3′端有 poly(A)尾巴的結(jié)構(gòu)。與 mRNA 相比，lncRNA 在不同物種間保守性更差，表達(dá)水平也更低。從發(fā)現(xiàn)之初，不具有生物學(xué)功能的“轉(zhuǎn)錄噪音”到現(xiàn)在的“明星分子”，大量的研究表明，lncRNA 在正常細(xì)胞功能維持和疾病發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要作用。例如：有研究顯示定位于失活 X 染色體的 lncRNAXist 包被將要失活的 X 染色體，并招募多梳抑制復(fù)合體 2 移行至 X 染色體失活中心，在 X 染色體失活過程中發(fā)揮了重要作用[26]，這一研究提供了第 1 個(gè)直接的證據(jù)，揭示了與蛋白質(zhì)調(diào)控方式不同，lncRNAs 可以利用它們的基因組信息（包括環(huán)境和位置）來發(fā)揮作用，將靶標(biāo)集合到一起；還有l(wèi)ncRNA-LALR1 能夠招募 CTCF 至 Axin1 啟動(dòng)子區(qū)域從而抑制 Axin1 的表達(dá)，進(jìn)而激活 Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路，促進(jìn) Cyclin D1 表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[27]；

圖 1-2 lncRNA 調(diào)控機(jī)制在骨組織工程、臨床與基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些 lncRNA 可通過影響多種因子的表達(dá)，調(diào)控骨組織細(xì)胞功能，參與骨相關(guān)疾病的病理過程。新近的研究表明，成骨形成過程中 H19 表達(dá)顯著上調(diào)[30]。另一研究顯示，lncRNA DANCR 可招募多梳抑制復(fù)合體 EZH2，通過調(diào)控后者與成骨調(diào)節(jié)基因 Runx2 啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制成骨形成[31]。敲除人牙周膜干細(xì)胞的 DANCR 基因，可激活細(xì)胞β-catenin/Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，并促進(jìn)成骨細(xì)胞形成[32]。組蛋白去乙�；福⊿IRT1）作為一個(gè)重要的正向調(diào)節(jié)骨量和成骨形成的因子，其對(duì) lncRNA HIF1A-AS1 發(fā)揮調(diào)控成骨功能至關(guān)重要。研究顯示，過表達(dá) SIRT1 后，HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表達(dá)顯著減少，而基因敲除或藥理學(xué)阻斷 SIRT1 后 HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表達(dá)顯著增加[33]。誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化過程中，MEG3 高表達(dá)。正常成骨細(xì)胞靶向敲除 MEG3 后，BMP4 的表達(dá)顯著降低，成骨細(xì)胞分化功能受到抑制。外源性加入 BMP4 或異位 MEG3 過表達(dá)可用以治療多發(fā)性骨髓瘤患者的MSCs 成骨缺損[34]。微陣列分析人骨髓 MSC 與體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 2 周的軟骨細(xì)胞lncRNA 時(shí)，發(fā)現(xiàn) 3000 多 lncRNA 表達(dá)具有顯著差異，其中 3 個(gè) lncRNA

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文用。該技術(shù)運(yùn)用 10 種同位素的標(biāo)簽，將多肽的氨基基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，通過HPLC-MS/MS 分析技術(shù)，同時(shí)比較 10 組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。相對(duì)于其他蛋白定量技術(shù)，其檢測(cè)靈敏度高，低豐度蛋白也可被檢測(cè)；檢測(cè)范圍廣，幾乎任何物種的各類蛋白質(zhì)均可被分離鑒定；檢測(cè)通量高，10 組不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量可被同時(shí)鑒定分析；檢測(cè)效能高，通過氨基標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記率高，液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好，目前該技術(shù)已在很多對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為一種高通量、高靈敏度的方法與基因芯片一并成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的重要技術(shù)，是“功能蛋白質(zhì)組學(xué)”和“功能基因組學(xué)”的有力研究手段。采用這兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)構(gòu)建lncRNA-mRNA 和靶蛋白的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，將特異 lncRNA、蛋白機(jī)制作用研究與網(wǎng)絡(luò)研究相結(jié)合，極有可能找到高 G 環(huán)境下骨重建的有效力學(xué)作用靶點(diǎn)。

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本文編號(hào)：2798984